2017—2021年我國(guó)多個(gè)省份豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型流行病學(xué)調(diào)查

黃 英,陳翔鴻,楊 柳,龍?jiān)浦?宋文博,李倩倩,余道兵,梁 鞏,周明光,徐高原,黃 超,湯細(xì)彪

(武漢科前生物股份有限公司,湖北 武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV) 是已知的最小的動(dòng)物病毒之一,是包膜、單鏈DNA病毒,屬于圓環(huán)病毒科的圓環(huán)病毒屬,其基因組DNA呈環(huán)狀[1]。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)共有5種亞型,分別是PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2 d 和PCV2e[1]。PCV2共發(fā)生了2次比較大的抗原變異:2003年,PCV2b亞型取代PCV2a亞型成為全球大部分地區(qū)的優(yōu)勢(shì)毒株;2012年,在中國(guó)、北美和韓國(guó)的部分地區(qū),以前占優(yōu)勢(shì)的PCV2b亞型開(kāi)始被PCV2d亞型取代[2]。

PCV2主要靶向豬的脾臟和淋巴結(jié)等免疫器官,損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng)[3]。PCV2感染后會(huì)影響仔豬生長(zhǎng),引起母豬繁殖障礙,且保育豬和生長(zhǎng)育肥豬會(huì)出現(xiàn)體型消瘦和咳嗽、打噴嚏等呼吸系統(tǒng)疾病[4],給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然PCV2感染豬后不會(huì)產(chǎn)生致病性的癥狀,但其易與其他細(xì)菌和病毒混合或繼發(fā)感染,從而加重其致病性。當(dāng)豬場(chǎng)有PCV2感染時(shí),豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)、豬流感(Swine influenza,SI)和豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)易發(fā)或更加嚴(yán)重[5-7]。Pallarés 等[8]研究表明,豬群中PCV2單獨(dú)感染僅占1.90%,PCV2與豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,MHP)混合感染占35.5%,PCV2與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)混合感染占51.90%。MHP感染可加重病毒血癥,同時(shí)讓PCV2在淋巴結(jié)和肺臟中存留的時(shí)間更久[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2017—2021年于湖北、河南、湖南、江西、浙江、河北、福建和山東8個(gè)省份127個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)共采集2 357份樣品。樣品來(lái)源的豬只具有生長(zhǎng)遲緩、停滯,呼吸困難,消瘦,間或出現(xiàn)黃疽[疑似為仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)];或皮膚出現(xiàn)紫斑和丘疹,主要是后肢和會(huì)陰部,嚴(yán)重病例在耳部、腹部甚至全身出現(xiàn)紫斑和丘疹[疑似為豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephrotic syndrome,PDNS)];母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎增多和初生仔豬死亡等[疑似為母豬繁殖障礙綜合征(Sow reproductive disorder syndrome,SRDS)]癥狀。采集樣品包括:肺臟、心臟、淋巴結(jié)、腎臟、肝臟、脾臟等組織臟器,以及全血、胎衣、臍帶血、鼻腔拭子、糞便。

1.1.2 主要試劑rTaqMix酶,購(gòu)自TaKaRa(大連)公司;OMEGA Viral DNA Kit、DL 2 000 DNA Marker,均購(gòu)自TransGen生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器 低溫冰箱(海爾公司生產(chǎn));臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和Mastercyclerep 384梯度PCR儀(Eppendorf公司生產(chǎn));DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠生產(chǎn));立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司生產(chǎn));凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)ProteinSimple公司生產(chǎn));潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 PCV2鑒定通用引物設(shè)計(jì) 于GenBank中下載20株P(guān)CV2毒株序列(序列信息見(jiàn)表1),將序列進(jìn)行多重比對(duì),根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)用于鑒定PCV2的通用引物 (PCV2F和PCV2R),引物序列:PCV2F:5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′;PCV2R:5′-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為494 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 20株P(guān)CV2參考毒株序列Table 1 Sequences of 20 PCV2 reference strains

1.2.2 病料處理和DNA提取 在生物安全柜中將各待檢組織去除被膜和結(jié)締組織,取1 g左右于平皿中剪碎,加入2倍體積的滅菌PBS,于滅菌研磨器中研磨,勻漿后轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 mL EP 管中,置-70 ℃以下反復(fù)凍融3次,12 000 r/min、2～8 ℃離心10 min,收集上清液;收集2 mL全血或臍帶血于滅菌1.5 mL EP管中,5 000 r/min離心10 min,收集上清;用棉簽蘸取胎衣的分泌物,置于滅菌PBS,5 000 r/min離心10 min,收集上清;將鼻腔拭子和糞便分別置于滅菌PBS中,5 000 r/min離心10 min,收集上清。根據(jù)OMEGA Viral DNA Kit操作手冊(cè)提取DNA,使用50 μL ddH2O進(jìn)行洗脫,-15 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCV2 的PCR鑒定 以1.2.2中提取基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:DNA模板2 μL,rTaqMix 10 μL,PCV2F、PCV2R各1 μL(濃度為10 μmol/L),加入雙蒸水補(bǔ)至總反應(yīng)體系共20 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,2～8 ℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 PCV2全基因組序列擴(kuò)增 于GenBank中下載20株P(guān)CV2毒株序列(序列信息見(jiàn)表1),將序列進(jìn)行多重比對(duì),根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)引物用于擴(kuò)增 PCV2全基因組序列片段(1 767 bp),P1:5′-GTACCTTGTTGGAGAGCGGG-3′;P2:5′-TCACAGC-AGTAGACAGGTCA-3′。采用50 μL PCR反應(yīng)體系:DNA模板3 μL,Prime STAR Max Premix(2×)25 μL,P1、P2引物各2 μL,加入雙蒸水補(bǔ)至總反應(yīng)體系共50 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃ 2 min;98 ℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。以雙蒸水為陰性對(duì)照。

1.2.5 PCV2全基因組序列測(cè)序 將擴(kuò)增獲得的PCV2全基因組序列產(chǎn)物連入pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐抗性的平板,置于37 ℃溫箱培養(yǎng),待其長(zhǎng)成單菌落后,挑取白色單克隆,接種到LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,收集菌液后提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR鑒定正確后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.6 PCV2全基因組核苷酸序列分析 以GenBank中20株P(guān)CV2毒株(表1)的全長(zhǎng)序列為參考,利用MEGA 7軟件對(duì)來(lái)源于華中地區(qū)的50株P(guān)CV2毒株的全基因組核苷酸序列進(jìn)行全序列比對(duì)分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.7 混合感染分析 對(duì)已檢出為PCV2陽(yáng)性的病料,依據(jù)不同疾病診斷方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),采用PCR方法分別進(jìn)行PRRS(GB/T 18090—2008)和PR(GB/T 18641—2018)的病原檢測(cè),并進(jìn)行MHP(GB/T 35909—2018)、豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)(GB/T 19915.7—2005)和副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)(GB/T 34750—2017)的檢測(cè),分析混合感染情況。

2 結(jié)果

2.1 病料PCV2檢測(cè) 采集臨床具有PMWS癥狀的疑似病例樣品共1 202份,進(jìn)行PCV2病原檢測(cè),結(jié)果陽(yáng)性為684份,陽(yáng)性率為56.91%;采集臨床具有PDNS癥狀的疑似病例樣品共990份,進(jìn)行PCV2病原檢測(cè),結(jié)果陽(yáng)性為659份,陽(yáng)性率為66.57%;采集臨床具有SRDS癥狀的疑似病例樣品共165份,進(jìn)行PCV2病原檢測(cè),結(jié)果陽(yáng)性為93份,陽(yáng)性率為56.36%;共計(jì)采集具有臨床疑似癥狀的樣品2 357份,陽(yáng)性1 436份,總體陽(yáng)性率為60.92%(表2)。

表2 具有臨床癥狀的疑似病例的PCV2檢測(cè)Table 2 Detection of PCV2 in suspected cases with clinical symptoms

2.2 PCV2感染情況分析 不同省份的PCV2檢測(cè)分析結(jié)果見(jiàn)表2和圖1,檢測(cè)的8個(gè)省份的PCV2陽(yáng)性率介于52.17%～67.78%,平均值為60.92%,其中華中地區(qū)(湖北、河南、湖南)的陽(yáng)性率介于53.69%～67.78%,平均值為60.04%。不同年份的PCV2檢測(cè)分析結(jié)果見(jiàn)圖2,2017—2021年收集樣品的PCV2陽(yáng)性率分別為58.42%、71.85%、61.08%、50.53%和54.73%。

圖2 2017—2021年具有臨床癥狀的疑似樣品的PCV2檢測(cè)Fig.2 Detection of PCV2 in suspected samples with clinical symptoms from 2017 to 2021

2.3 PCV2全基因組核苷酸序列分析 將來(lái)源于華中地區(qū)的50株P(guān)CV2毒株的全基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序(50株P(guān)CV2毒株的來(lái)源見(jiàn)表3),然后與20株P(guān)CV2參考毒株(表1)的核苷酸序列進(jìn)行全基因組核苷酸序列比對(duì)分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖3所示,PCV2d亞型占陽(yáng)性樣品數(shù)的80%(40/50),PCV2a亞型占4%(2/50),PCV2b亞型占16%(8/50),未發(fā)現(xiàn)PCV2c和PCV2e亞型,表明PCV2d亞型是2017—2021年我國(guó)華中地區(qū)PCV2的主要流行毒株。

圖3 50株P(guān)CV2毒株全基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 50 PCV2 strains based on complete genome sequences

2.4 混合感染分析 對(duì)1 436份已檢出PCV2陽(yáng)性的病料進(jìn)行混合感染檢測(cè),結(jié)果如圖4所示,PCV2和PRRSV(22.08%)以及PCV2與MHP、SS的混合感染率(18.31%)均高于PCV2的單一感染率(15.18%)。

3 討論

PCV2作為近年來(lái)常見(jiàn)多發(fā)的一種免疫抑制病,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著 PCV2疫苗及相關(guān)的診斷試劑在我國(guó)及世界范圍的廣泛應(yīng)用,PCV2感染造成的疫病嚴(yán)重程度明顯降低[10],然而,該病毒依然在豬群中廣泛存在,沒(méi)有得到徹底的清除。PCV2具有多種傳播方式[11],在世界范圍內(nèi)廣泛存在。不僅能在豬的各種組織包括肺臟、胸腺和肝臟等檢測(cè)到PCV2,而且在其血液、口腔液、斷尾液、精液也均可以檢測(cè)到PCV2[12,13]。PCV2主要侵害豬的免疫器官,導(dǎo)致免疫抑制,從而容易繼發(fā)其他病原的混合感染,例如PRRSV、偽狂犬病病毒、HPS、MHP和SS等[14]。此外,不同PCV2毒株之間變異顯著[15]。上述因素都無(wú)疑加大了豬圓環(huán)病毒病的防控難度。

本試驗(yàn)對(duì)2017—2021年全國(guó)8個(gè)省份的127個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)進(jìn)行病料采集,采用PCR方法進(jìn)行PCV2檢測(cè),結(jié)果顯示,8個(gè)省份的PCV2陽(yáng)性率介于52.17%～67.78%,其中華中地區(qū)(湖北、河南、湖南)的陽(yáng)性率為介于53.69%～67.78%,平均值為60.04%,這比Xu 等檢測(cè)的2015—2017年華中地區(qū)PCV2陽(yáng)性率57.04%略高[16],因?yàn)楸驹囼?yàn)的樣品數(shù)更多,且檢測(cè)的年份也不一樣,可能導(dǎo)致結(jié)果有差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在2017—2021年期間PCV2陽(yáng)性率介于50.53～71.85%,呈現(xiàn)先升高再降低然后再升高的趨勢(shì)。此外,PCV2不僅單獨(dú)感染檢出率高,而且混合感染比例也很高,尤其是與PRRSV、MHP和SS等病毒或細(xì)菌的混合感染較多。本試驗(yàn)對(duì)50株來(lái)源于我國(guó)華中地區(qū)的PCV2進(jìn)行全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)PCV2d亞型是2017—2021年我國(guó)華中地區(qū)PCV2的主要流行毒株,這與Xu等的研究結(jié)果一致[16,17]。本試驗(yàn)結(jié)果為我國(guó)針對(duì)PCV2疾病的防控提供了極其有價(jià)值的參考。