2021年我國部分省份豬圓環病毒2型流行病學調查和基因分析

黃正波,崔 進,張 慧,尼 博,劉 爽,張 鋒,董雅琴,魏 榮,代飛燕,吳發興

[1.云南農業大學動物醫學院,云南 昆明 650201 ; 2.中國動物衛生與流行病學中心,山東 青島 266032 ;3. 農業農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室(南方),山東 青島 266032]

豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)屬于圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬(Circovirous),為單股負鏈環狀DNA病毒。PCV感染能夠引起斷奶仔豬多系統衰弱綜合征、豬皮炎腎病綜合征等。PCV可導致豬產生免疫抑制,使豬抵抗力降低,從而繼發其他疫病的發生。臨床中PCV易與豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等其他病原混合感染[1]。

根據基因型的不同,PCV可以分為豬圓環病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)、豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)和豬圓環病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)3個血清型,其中PCV2為對我國影響較為嚴重的血清型[2]。目前,PCV2可以分為5種基因亞型,包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e亞型,其中除PCV2c亞型外,其他基因亞型均存在于我國豬群中[3]。系統發育分析比較表明,PCV2b亞型在2007—2014年期間在意大利北部最為流行[4]。我國PCV2流行毒株于2000年由PCV2a亞型向PCV2b亞型轉換,且PCV2b亞型毒株數量逐漸增加并存在基因缺失的變異株[5]。目前,PCV2d亞型毒株已經在全球范圍內廣泛存在,我國也正在發生從PCV2b亞型到PCV2d亞型的過度[6]。2016年,PCV2e亞型在我國山西省[7]、湖北省[8]被發現。

PCV2基因組有3個主要的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),其中,ORF2基因編碼的衣殼蛋白(Capsid protein,Cap)是一種PCV特有的結構蛋白,也是PCV2的主要抗原決定簇,與病毒免疫原性有關,常用于分析PCV2的遺傳多樣性,且ORF2基因的核苷酸突變也使得PCV2不斷進化并伴有新毒株的出現[9]。本試驗對2021年我國7個地區共16個省、市、自治區的豬源樣品進行PCV2流行病學調查,分析我國PCV2的感染情況和遺傳變異趨勢,以期為PCV2的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和區域劃分 2021年分別于天津市、黑龍江省、新疆維吾爾族自治區等16個省、市、自治區進行樣品采集,將16個省、市、自治區劃分為7個地區:華北地區(北京市、天津市、河北省)、華東地區(山東省、安徽省、福建省)、東北地區(黑龍江省、遼寧省)、華中地區(河南省、湖南省)、華南地區(廣東省、廣西壯族自治區)、西北地區(陜西省、新疆維吾爾自治區)、西南地區(貴州省、云南省)。為獲得真實有效的數據,本試驗采取隨機采樣的方式,依據各地屠宰場的數量和規模,并在工作便利性和條件限制性的基礎上,于以上7個地區隨機選取10家以上的屠宰場進行采樣,各地區均需采集樣品200份以上,共計從107個屠宰場中采集到1 685份組織(脾臟、淋巴結、肺臟等)樣品,保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑 TaKaRaExTaq?Hot Start Version RR006a和PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye) RR902a,均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;病毒DNA/RNA提取試劑盒(4.0),購自西安天隆科技有限公司。

1.3 主要儀器 NP968-C核酸提取儀,西安天隆科技有限公司產品;CFX96 Real-Time PCR Detection System和BIO-RAD凝膠成像系統,美國伯樂公司產品;2720 Thermal Cycler PCR儀,美國 Applied Biosystems公司產品。

1.4 組織樣品處理 將各組織樣品剪碎,加入1 mL PBS研磨,2 000 r/min離心 10 min后取上清,按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書操作,分別提取1 685份組織樣品總DNA,保存于-20 ℃備用。

1.5 實時熒光定量PCR檢測 參考我國PCV2流行毒株的全基因組序列,設計PCV2實時熒光定量PCR檢測方法引物和探針。引物序列:上游引物PCV2/F:5′-GGATATTGTAGTCCTGGTCG-3′;下游引物PCV2/R:5′-CCACTATTGATTACTTCCAACC-3′;探針序列:PCV2/real-Probe:5′-FAM-TCGAACGCAG-TGCCGAGGCC-BHQ1-3′,引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以1.4中提取的DNA為模板進行檢測,實時熒光定量PCR擴增反應體系(總體積為25 μL):10×Buffer 2.5 μL,dNTPs 2.0 μL,ExTaqHS 0.2 μL,上、下游引物各0.5 μL,探針0.5 μL,ddH2O 16.8 μL,模板2.0 μL。反應程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性10 s,62 ℃退火20 s,共計45個循環。結果判定標準:Ct<35為陽性,35≤Ct≤37為疑似,Ct>37為陰性。需要對疑似結果進行復檢,如復檢結果為陽性則記為陽性,復檢結果仍為疑似或陰性記為陰性。統計各省、市、自治區以及7個地區的樣品陽性率和場陽性率[場陽性率(%)= 檢出陽性的場數÷總場數×100%]

1.6 PCV2全基因組PCR擴增 參考我國PCV2流行毒株的全基因組序列,設計PCV2全基因組分段PCR擴增引物。第1段PCR引物序列:上游引物PCV2/F1:5′-TCCGCTGCCACATCGAG-3′;下游引物PCV2/R1:5′-AAACTACTCCTCCCGCCACA-3′,擴增產物大小為1 007bp。第2段PCR引物序列:上游引物PCV2/F2:5′-ATTGTACATACATGGTTACACGGAT-3′;下游引物PCV2/R2:5′-GAACGGTCACCAGACTCCC-3′,擴增產物大小為1 025bp,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。第1段和第2段PCR擴增反應體系(50 μL):DNA模板5.0 μL,上、下游引物各1.0 μL,ExTaqVersion 2.0 plus dye 25.0 μL,去離子水18.0 μL。第1段和第2段PCR擴增反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性1 min,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃ 10 min。選取45份實時熒光定量PCR檢測結果為陽性的樣品進行全基因組PCR擴增,第1段和第2段PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,核酸擴增為陽性的樣本送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果使用DNASTAR 軟件拼接,獲得全基因組序列。

1.7 PCV2全基因組序列比對分析 用DNASTAR 軟件將45株分離毒株的全基因組序列與GenBank數據庫中的26個參考序列(表1)進行同源性分析。用MEGA 6.0軟件,以Minimum-Evolution方法繪制分子遺傳進化樹。用MegAlign軟件,以Clustal W方法比對ORF2基因序列和Cap蛋白氨基酸序列。

表1 參考毒株Table 1 Reference strains

2 結果

2.1 PCV2流行病學調查 組織樣品PCV2實時熒光定量PCR檢測結果如表2所示,被檢樣品總陽性率為9.85%(166/1 685),場總陽性率為32.71%(35/107);各地區樣品陽性率介于4.29%～19.00%,其中東北地區最高,為19.00%,西北地區最低,為4.29%;各地區場陽性率介于6.90%～60.00%,其中華中、東北、華東地區場陽性率較高,分別為60.00%、53.85%、50.00%,華北、西南、華南、西北地區次之,分別為33.33%、30.00%、29.14%、6.90%。除北京市、陜西省和貴州省外,其余各省、市、自治區均檢出PCV2。PCV2陽性省份中,天津市、山東省、黑龍江省等7個省、市樣品陽性率高于10.00%;河北省、安徽省、湖南省等6個省、自治區的樣品陽性率低于10.00%;廣東省樣品陽性率最高,為30.00%,廣西壯族自治區樣品陽性率最低,為2.22%。PCV2陽性省份中,場陽性率最高的省份為湖南省,達到100%,最低的省份為新疆維吾爾自治區,為8.33%。

表2 2021年各地區PCV2感染情況Table 2 PCV2 infection in each regions in 2021

2.2 PCV2全基因組序列比對分析 選取45份PCV2陽性樣品進行全基因組測序分析,結果顯示,45株PCV2分離毒株的同源性介于94.2%～100%,與參考毒株間的同源性介于94.1%～100%;在45份樣品中共檢出PCV2a、PCV2b、PCV2d三種亞型(圖1),其中14株分離毒株為PCV2a亞型,占比為31.11%;2株分離毒株為PCV2b亞型,占比為4.44%;29株分離毒株為PCV2d亞型,占比為64.44%;未檢測到PCV2c和PCV2e亞型。

圖1 PCV2全基因組遺傳進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of PCV2 whole genome▲:本試驗分離毒株▲:Strains isolated in this study

2.3 分離毒株ORF2基因和Cap蛋白序列分析 45株分離毒株的ORF2基因長度介于702～705 nt,其中14株PCV2a亞型分離毒株的ORF2基因核苷酸同源性介于92.3%～100%,與7株參考毒株核苷酸序列同源性介于91.8%～100%;2株PCV2b亞型分離毒株的ORF2基因核苷酸同源性為100%,且與7株參考毒株核苷酸序列同源性介于96.2%～100%;29株PCV2 d亞型分離毒株的ORF2基因核苷酸同源性介于98.3%～100%,且與10株參考毒株核苷酸序列同源性介于96.2%～100%。

ORF2基因編碼Cap蛋白的氨基酸序列比對分析結果顯示,PCV2a亞型分離毒株的第86～91位氨基酸序列為TNKISI,PCV2b亞型分離毒株為SNPRSV;PCV2d亞型分離毒株為SNPLTV(圖2)。PCV2a亞型分離毒株第190、191、206、210位的氨基酸序列為SR(K)DK,PCV2b亞型分離毒株為TGIE,PCV2d亞型分離毒株為TGID(圖3)。有24株PCV2分離毒株的ORF2基因終止密碼子發生突變,由TAA突變為AAA或AAG,導致ORF2基因由702個核苷酸變為705個核苷酸,其編碼的Cap蛋白在C末端有1個賴氨酸(K)延伸,這24株PCV2分離毒株均為PCV2d亞型;另有1株PCV2d亞型分離毒株的ORF2基因終止密碼子由TAA突變為ATG,ORF2基因由702個核苷酸變為705個核苷酸,其編碼的Cap蛋白在C末端有1個蛋氨酸(M)延伸。

3 討論

本調查涉及我國7個地區共16個省、市、自治區,共采集1 685份組織樣品,樣品總陽性率為9.85%,場總陽性率為32.71%。7個地區的樣品陽性率介于4.29%～19.00%,其中東北、華南和華東地區的樣品陽性率超過10.00%,表明這些地區PCV2感染較為嚴重;各地區的場陽性率介于6.90%～60.00%,其中華中、東北和華東地區的場陽性率超過50.00%,提示這些地區PCV2的污染面較廣;各地區中西北地區的樣品陽性率和場陽性率均最低,分別為4.29%和6.90%。北京市、陜西省和貴州省在此調查中未檢測出PCV2,其余省份的樣品陽性率介于2.22%～30.00%,場陽性率介于8.33%～100%。生豬主產區山東省、安徽省、黑龍江省、廣東省、湖南省和云南省等省份的場陽性率均高于50.00%,進一步證明我國PCV2的流行具有程度深、污染廣的特點。除采樣范圍和樣品數量不均等因素外,各地區樣品陽性率和場陽性率差異大的原因還可能與各地區的養殖密度、生物安全水平、交易頻率差異等因素有關。

梁鵬帥等[10]采用套式PCR方法對我國華南地區2010—2011年間采集的807份豬血清樣品進行檢測,結果發現,PCV2的陽性率為30.61%;郭建超等[11]采用PCR方法對華南地區2017年采集的26個種豬場的血液樣品進行檢測,PCV2的總體感染率為37.87%,而本調查華南地區樣品的PCV2陽性率為12.56%。山東省在2015—2018年間的PCV2總體平均陽性率達36.98%[12]。云南省在2016—2019年間的PCV2陽性率為60.93%[13]。與上述研究相比,本調查結果表明,雖然我國PCV2的污染面仍較廣,但其樣品陽性率有所下降,這可能與非洲豬瘟感染造成的飼養密度下降、防控政策變化和養殖主體生物安全水平提高有關。

PCV2a亞型是在我國發現最早的亞型,近年來PCV2d亞型的檢出率有所提高,逐步成為我國PCV2的主導基因型[14,15],這種現象的發生可能與疫苗的使用有關[16]。蔡擴軍等[17]對新疆地區PCV2分離毒株進行基因遺傳進化分析,結果顯示,PCV2d亞型可能成為該地區的優勢基因型。2013年,孟張麗等[18]對廣東地區經PCV2疫苗免疫后受PCV2感染的病豬進行病毒分離,結果顯示,5/9的分離毒株為PCV2d亞型、3/9為PCV2b亞型、1/9為PCV2a亞型。張民秀等[1]研究發現,2014—2016年廣西地區豬群受到PCV2d亞型感染的病例呈現增多的趨勢。本調查結果顯示,PCV2陽性樣品中PCV2a亞型占31.11%,分布于福建省、天津市、黑龍江省等地;PCV2d亞型占64.44%,分布于黑龍江省、廣東省、福建省等地區;PCV2b亞型占4.44%,分布于遼寧省、新疆維吾爾自治區等地。結果表明,2021年PCV2a、PCV2b和PCV2d亞型的PCV2在我國豬群中流行,其中PCV2d亞型占比較高,但PCV2d亞型是否已成為我國PCV2的主導基因型還需要收集更多的序列進行下一步研究。

PCV2的全基因組大小為1 767或1 768個核苷酸[5,19]。本試驗全基因組測序分析發現,45株PCV2分離毒株的全基因組大小與前人研究報道一致。有報道稱,存在全基因組大小為1 766個核苷酸的PCV2毒株[20],本試驗未發現類似毒株。本試驗PCV2分離毒株的ORF2基因核苷酸同源性介于92.3%～100%,與我國各地區參考毒株具有較高的同源性,且無明顯的地域性,相似毒株的大面積感染可能與各地區間感染PCV2的生豬頻繁交易有關。

研究表明,PCV2ORF2基因長度介于702～705 nt[9]。本試驗中共有25株PCV2分離毒株的ORF2基因終止密碼子發生突變,導致ORF2基因由702個核苷酸變為705個核苷酸,這25株PCV2分離毒株均為PCV2d亞型,其中24株分離毒株的Cap蛋白在C末端有1個賴氨酸(K)延伸,1株分離毒株的Cap蛋白在C末端有1個蛋氨酸(M)延伸,這種末端延伸和突變是否對病毒產生影響仍需進一步研究。

PCV2 Cap蛋白具有最多的抗原表位,這些表位的氨基酸變化能夠影響單克隆抗體與病毒的結合[21]。PCV2各亞型Cap蛋白的氨基酸序列存在差異,PCV2a亞型基序為TNKISI(AA86～91),PCV2b亞型基序為SNPRSV(AA86～91),PCV2d亞型基序為SNPLTV(AA86～91)[14],本試驗結果與此一致。Cap蛋白的第190、191、206、210位氨基酸對PCV2的體外復制至關重要[22],PCV2a亞型基序為SRKD(AA190/191/206/210)[23],PCV2b亞型基序為AGIE(AA190/191/206/210)或TGIE(AA190/191/206/210),PCV2d亞型基序為TGID(AA190/191/206/210)[24],本試驗PCV2b和PCV2d亞型分離毒株的基序與上述研究報道一致,而部分PCV2a亞型分離毒株的基序出現SKKD(AA190/191/206/210)的突變。Cap蛋白的第173、174、175、179位氨基酸對抗體識別至關重要[25],本試驗中3個亞型PCV2的這4個位點均保守。

本試驗結果表明,2021年我國PCV2感染范圍廣,污染程度高,且正在不斷發生遺傳變異,PCV2流行毒株中PCV2d亞型占比最高。大范圍的感染可能促使PCV2不斷的發生遺傳進化,產生新的變異株,近年新發現的PCV2e亞型可能與此有關,因此需要持續的跟蹤監測PCV2的流行情況,制定有效防控措施。