肝細胞源外泌體miRNAs在肝脂毒性發生過程中的作用

張道亮,王希春,吳金節,李 玉

(安徽農業大學 動物科技學院,安徽 合肥 230036)

高非酯化脂肪酸(nonestes-terified fatty acid,NEFA)血癥是酮病的主要病理學特征之一,且高NEFA是引起肝脂毒性的主要原因,奶牛高NEFA血癥環境下肝細胞產生的外泌體可能影響肝細胞的內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和脂質凋亡,從而導致發生肝脂毒性。ERS是指細胞在生長物質攝入發生大幅度調整、糖基化作用、鈣離子代謝紊亂、活性氧、缺氧和微生物感染等內源性和/或外源性影響因素的刺激下,細胞自我調節穩態的功能被損害,蛋白質處理與轉運過程出現障礙,致使未折疊蛋白或錯誤折疊在其腔室內堆積,內質網的結構與功能受損,使細胞發動應激反應,以便內質網功能恢復并調節內環境動態平衡。泌乳早期奶牛主要的營養代謝紊亂性疾病,以出現NEFA血癥為臨床病理學特征,發生酮病的奶牛會表現出脂毒性肝損傷[1]。肝臟是奶牛酮病發生過程中的中心器官,同時也是NEFA產生的主要部位和肝脂毒性發生的主要器官。奶牛食欲下降,血糖濃度降低,脂肪代謝紊亂,高NEFA血癥導致酮體產生增多,促發奶牛罹患子宮內膜炎、乳腺炎、創傷性網胃炎、真胃變位和免疫抑制,給奶牛養殖業造成巨大的經濟損失[2]。外泌體作為細胞外囊泡之一,可從任意機體組織提取,在其外層脂質層內包裹有蛋白質、脂類物質、mRNA和miRNA以及其表面鑲嵌的信號受體等進行遠距離調控的細胞信使[3]。普遍認為外泌體可作為機體物質代謝與疾病狀態的標志物,有研究表明,外泌體miRNA可用于治療代謝性疾病[4-5]。但是,外泌體是否參與奶牛酮病脂毒性的發生過程及其導致脂毒性的具體機制尚未明確。在過去的研究結果中,酮病奶牛血漿源和肝組織源外泌體可以向體外培養肝臟細胞傳遞內源性信號,從而對肝脂代謝產生影響,但作用機制還不是很明確,仍待進一步探索研究。而使這些細胞發揮相應效應的有效機制之一是循環外泌體在細胞間的信息傳遞,以此種方式統籌調動多種細胞功能,才使得內環境穩態維持正常水平。因此,研究循環外泌體在細胞間信息傳遞的分子機制,對于全面了解、掌握各種肝臟疾病的發生發展機制,以及尋找合適的治療靶點具有重要意義。本文就奶牛肝細胞源外泌體在奶牛肝脂毒性發生中的作用進行了綜述。

1 高NEFA血癥引發的肝臟病理變化

NEFA能表現出極強的細胞毒性,對細胞的生物膜結構進行破壞,使得細胞和細胞器受損;它還能增強某些細胞因子毒性,從而在許多疾病的病理變化中發揮重要作用。肝細胞受到高NEFA作用可致使肝細胞細胞器線粒體、內質網膨脹和膜結構通透性增加,進而導致肝細胞出現病理性變化,如變性、壞死和炎性浸潤。肝脂毒性的加劇與肝脂代謝紊亂密切相關。當能量負平衡時,機體會進行脂肪動員,但產生過多的NEFA,從而使血中NEFA含量增加;當肝臟攝取過多的NEFA,超出肝細胞內質網對NEFA的氧化能力,促使其合成甘油三脂(triglyceride,TAG)增加,并且轉運載體轉運能力不足,導致TAG在肝臟中蓄積,產生肝脂毒性效應。

1.1 高NEFA血癥可引起肝臟ERS高濃度NEFA是誘發機體ERS的重要原因。ERS是細胞為應對內質網未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白過度沉積做出的生理和病理反應。已有研究表明,肥胖情況下,未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)引起的肝臟生物化學變化和圍產期奶牛出現脂肪肝和酮病時的變化相似,因此ERS及其伴隨的UPR可能參與了奶牛酮病的形成[6]。酮病情況下的高NEFA血癥會進一步導致奶牛肝臟發生代謝性應激,ERS在其中起著關鍵作用。血液NEFA水平升高,超出肝臟β-氧化的能力后,NEFA就會轉化為TAG貯存在肝臟組織中。牛、羊等反芻動物載脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)的合成能力較非反芻動物低,極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein,VLDL)的合成轉化和分泌也不如后者,在肝臟中出現TAG過度積累,加劇脂代謝紊亂情況下的脂毒性,直接影響內質網穩態,從而引起ERS[7]。越來越多的研究結果表明,泌乳早期高NEFA血癥奶牛肝臟發生ERS,過量的脂肪酸蓄積導致肝細胞的ERS[6,8]。雖然眾多的因素可引起ERS,但可以明確的是NEFA是泌乳早期奶牛肝臟發生ERS最有可能同時也是最重要的潛在因素。隨后的體外試驗也證實,犢牛肝細胞原代培養中ERS傳感器相關因子和相關酶的激活對NEFA劑量表現依賴性,進一步表明脂肪酸可誘導奶牛肝臟ERS[9]。通過添加高脂飲食的方法,也可以誘導肝臟ERS,并且ERS的發生早于脂沉積,說明ERS參與肝脂毒性的形成[10]。

1.2 高NEFA血癥可引起肝臟脂質凋亡肝細胞脂質凋亡是肝脂毒性的另一病理學特征。眾所周知,ERS可以誘導細胞死亡和凋亡,ERS誘導的損傷過度而體內平衡不能恢復后,UPR可以通過誘導凋亡而導致細胞死亡[11]。高NEFA引起的脂質蓄積會引起細胞功能紊亂和細胞死亡(脂質凋亡)。最近的研究表明,酮病奶牛存在一定程度的肝臟凋亡,而且NEFA可以引起體外培養的奶牛肝細胞發生脂質凋亡現象[12-13]。亦有報道稱,ERS介導脂毒性誘導的腎近端細胞和β細胞凋亡[14-15]。由此可見,高濃度的NEFA可以引起肝臟或肝細胞發生ERS和脂質凋亡,ERS也可導致細胞凋亡。

2 外泌體參與高NEFA血癥引起的肝臟病理變化

外泌體作為重要的媒介在細胞間發揮著相互作用,外泌體生物發生是蛋白質質量控制的一種機制,一經釋放,外泌體就可以發揮各種各樣的作用,如重塑細胞外基質,在各種生理情況與病理狀態下發揮不可忽略的作用,其內含的蛋白質、核酸和脂質,可作為細胞間信息傳遞的載體而表現生物學功能,并且在肝臟疾病的病理進程可以檢測出相關表達[16-17]。由此可見,外泌體參與慢性肝病的發生和發展過程。但是,尚未有報道將高NEFA血癥環境下外泌體與肝臟脂毒性損傷聯系在一起,進而研究高NEFA血癥環境下外泌體對奶牛肝脂毒性的加劇作用。關于外泌體是否能生長與分裂,以及在適當的環境下,參與信號傳導的方式及靶向范圍和自主調節的生化反應過程,仍有待確定。目前尚不清楚外泌體在未經干預的生理水平是否在體內發揮調節內環境穩態或病理過程發生的功能,該研究迫切需要建立可靠的動物模型來探究揭示外泌體的生物來源及發生、運輸與識別和細胞靶向與融合。

2.1 外泌體與外泌體miRNA研究進展目前,奶牛外泌體的研究報道主要集中在奶牛血漿、腎細胞、乳汁和脂肪組織,并且以外泌體作為標志物,分析其對奶牛機體代謝狀態和藥物轉運的影響[3-4,18]。但是外泌體存在于機體任意組織器官和體液中,比如實質性器官肝臟、膀胱液亦或是腺體組織中都可以分離得到外泌體(圖1)。外泌體是粒徑為40～160 nm(平均在100 nm左右)的細胞外囊泡,通過在質膜和內涵體膜上出膜外排,可通過高階寡聚蛋白復合物的膜結合方式融合,富含核酸、脂質和蛋白質,通過對來源組織細胞或其他靶細胞和組織進行調控,表現生物學效應[16,19]。外泌體miRNAs是沒有編碼功能的小片段RNA,只能通過與靶mRNA結合并擾亂其翻譯過程來影響目標基因表達相應蛋白。因此,近年來人們對外泌體尤其是miRNAs的作用產生了極大的研究興趣。目前,外泌體的研究主要集中在認識其在細胞間通訊、內臟器官穩態以及疾病的發生發展機制、診斷與治療方面。外泌體介導的細胞間通訊可以影響腫瘤生長、細胞遷移、抗病毒感染和肝細胞再生,表明外泌體作為診斷或治療工具具有巨大的潛力[20]。

2.2 外泌體miRNA參與高NEFA血癥引起的肝脂毒性高NEFA血癥和外泌體的變化密切相關。不論是肝臟的上皮細胞(亦即肝細胞和膽管上皮細胞),還是自然殺傷性T細胞(the natural killer T cells,NKT)、肝星狀細胞、成人干細胞及肝竇內皮細胞,均能釋放外泌體或被稱為外泌體的靶細胞[21]。而且POVERO等[22]通過對比非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFLD)模型小鼠與對照小鼠的循環血液及肝臟中外泌體水平,發現兩者之間具有顯著差異,并證明NAFLD動物模型中肝臟是外泌體的主要來源器官。脂毒性導致肝細胞機能受損時,肝細胞源外泌體釋放增加,并且肝臟的巨噬系統被廣泛激活[23]。以上研究均表明外泌體能密切參與到肝脂代謝過程。脂肪細胞衍生外泌體抵抗素呈遞率的降低可以降低肝臟脂肪變性,而對乙酰氨基酚引起小鼠肝損傷的肝細胞源外泌體會加劇受體肝細胞的脂毒性[24-25]。可見外泌體在肝臟脂毒性發生發展過程中起到細胞間通訊因子的作用。當缺血再灌注引起的肝臟損傷用正常肝細胞源外泌體處理后可以得到修復和再生,說明對于一定程度上受損的受體細胞,外源性的外泌體可以對損傷進行修復[23]。

另一方面,因微生物、對乙酰氨基酚和酒精等外源性因素和或其他內源性因素對肝臟細胞造成的損傷,這種損傷情況下肝組織源外泌體對自身肝組織細胞或者其他受體肝細胞都能造成一定程度的異常,進一步說明病理狀態下的肝組織源外泌體,能對受體細胞產生不良影響;如果是處理已經遭到損傷的受體細胞會發現原本的損傷被加重[26-27]。在高脂肪高蛋白飼喂條件下,小鼠靜脈血中提取分離得到的外泌體注射到對照組小鼠體內,可引起未分化完全骨髓細胞沉積在肝臟中,同時出現全身性炎癥反應,導致如脂肪肝疾病、糖尿病和冠狀溝脂肪推積等肥胖相關的代謝紊亂[28]。在體外試驗條件下,健康成人肝臟干細胞源外泌體能減緩肝細胞癌的擴增和轉移,也能促使細胞增殖和抗凋亡,當作用于70%肝切除模型鼠時,其肝臟形態結構和功能作用得以快速恢復[29]。原代肝細胞和Huh7細胞(分化肝細胞癌細胞系)在高濃度脂質試驗條件下提取得到的外泌體對巨噬細胞炎性反應有激活作用,進而誘導產生非酒精性脂肪肝炎(NASH)。這些研究證實在病理狀態下的細胞所分泌的外泌體會含具有特殊作用蛋白和miRNA,并且分泌量會顯著提高,這種情況可能是很多病理變化的始作俑者。外泌體對體內微環境的調控不僅能使癌細胞得以增殖或擴散,還能促使細胞重建聯系和恢復活性以平衡體內穩態。間充質干細胞合成分泌釋放的外泌體對肝細胞活性的提高有積極影響,并能促進肝細胞分裂增殖[30]。因此,外泌體參與肝臟疾病和損傷的過程,可作為其診斷與治療的潛在手段之一。酒精性脂肪肝疾病發生過程中,循環外泌體的數量增加,肝細胞釋放的外泌體轉導miRNA信號進入單個肝細胞,引起單個肝細胞的外泌體釋放增多[31]。

以上結果說明,外泌體在NAFLD和NASH中起著重要作用。高NEFA、高β-羥丁酸(BHB)奶牛和人類或者其他動物的NAFLD和NASH同樣表現出肝炎和脂肪酸蓄積的病理變化[32]。由此可見,外泌體同樣能參與高NEFA血癥奶牛的肝臟脂代謝紊亂及其相關的過程。有研究表明,圍產期奶牛血漿外泌體對奶牛腎細胞、子宮肌層外膜上皮和基質細胞具有一定的修復作用[33],但是,未見高NEFA血癥下的外泌體對受體細胞和組織毒性損傷的系統性報道。由此可見,外泌體參與維持機體內的穩態,在疾病發生發展過程中起著關鍵作用。

2.3 肝細胞源外泌體miRNA能夠通過ERS介導的脂質凋亡通路加劇高NEFA血癥引起的肝脂毒性外泌體、ERS和脂質凋亡均參與了肝臟脂毒性損傷,但是其參與的具體機制尚未闡明(圖2)。研究結果發現對乙酰氨基酚急性肝損傷來源外泌體能引起受體肝細胞死亡或發生毒性反應,同時上調受體細胞凋亡相關蛋白p-JNK/JNK、Bax和cleaved caspase-3的表達,表明外泌體通過凋亡途徑參與肝細胞的病理性損傷[25]。有研究表明,在體外細胞試驗中,棕櫚酸(脂毒性信號)處理肝細胞,可增加培養基中釋放的外泌體,說明外泌體參與了脂毒性的發生和發展過程[34-35]。NEFA引起的脂毒性,不僅可以引起氧化應激,還可以作為ERS的誘導因子[36-37]。同時有研究表明,高濃度的游離脂肪酸(FA)可以引起肝細胞的ERS,進而引起肝細胞的凋亡[38]。ERS主要與UPR密切相關,正常情況下,與ERS關聯的葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)同內質網中UPR的相關蛋白分子PERK、IRE1α和ATF6處于緊密結合狀態;當細胞受到刺激發生ERS后,UPR的主要介質從ERS的GRP78上解離,從而使PERK、IRE1α和ATF6活化,對下游靶基因GRP78、剪切型的X盒結合蛋白1和活性轉錄因子4進行調控[6,39]。有研究通過調節營養攝入引起鼠類肝脂毒性發生,結果表明UPR標志物cAMP反應元件結合轉錄因子p-eIF-2α和p-PERK表達量被上調,進一步證實ERS參與肝脂毒性的發生[40]。ERS本身是一把“雙刃劍”,長期或者過度的ERS會觸發凋亡,主要是活化CHOP和Caspase-12凋亡蛋白[41]。因此,內質網的穩態變化可能和凋亡的發生有直接的關聯。由此可見,外泌體可通過影響ERS和凋亡參與肝脂毒性的發生,而高NEFA通過影響ERS介導的脂質凋亡加劇肝脂毒性。綜上所述,外泌體通過ERS介導的脂質凋亡可能是高NEFA血癥加劇肝脂毒性的主要原因。

3 小結

酮病的主要病理學特征之一是高NEFA血癥,高NEFA血癥可通過誘導ERS和脂質凋亡,從而加劇其自身引起的肝脂毒性。在ERS和肝脂毒性的病理發生過程中酮病肝臟源外泌體發揮著重要作用。在不同作用條件下,大多數的組織細胞通過于組織間或外周循環系統中釋放含有外泌體的調節物質,對機體的變化起著遠程調控的作用。高脂飲食條件下肝細胞源外泌體能加劇因肝脂毒和脂質沉積異常,外泌體的miRNAs在細胞間傳遞著信號,影響著受體對象脂質合成氧化轉運相關基因的表達和蛋白翻譯,這些為闡明ERS-脂質凋亡通路提供理論依據。隨著目前研究手段得到相應科技水平的支持,外泌體的研究已經在很多領域開展,從其作為一種信號傳導分子及在很多疾病的早期診斷起重要作用,以及作為治療藥物的轉載工具等方面對其進行了深入研究。當然肝細胞源外泌體miRNAs在肝脂毒性的發生發展過程中起到的具體機制還不是很清楚,相信在研究ERS-脂質凋亡信號通路在肝脂毒性加劇中起到的作用機制后能完善肝脂毒性發生的現象和為此繼發病理現象的原發疾病尋找治療靶點提供理論支持,如奶牛酮病。