日本乙型腦炎病毒蛋白與宿主蛋白相互作用的研究進展

袁盛林,湯德元,陳閶崢,羅 柳,陳 旭,廖正波

(貴州大學 動物科學學院, 貴州 貴陽 550025)

日本腦炎(JE)是由蚊媒傳播的日本腦炎病毒(JEV)引起的,為單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科黃病毒屬人畜共患病病原[1-2]。是亞洲病毒性腦炎的主要原因,其RNA基因組約有11 kb,編碼3種結構蛋白:衣殼蛋白(C)、膜蛋白(pr M/M)和包膜蛋白(E),以及7種非結構(NS)蛋白:NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5,它們被翻譯為前體多蛋白[3]。JE是人類最常見的地方性腦炎之一,在動物中也時常發生,尤其是在整個南亞地區、東南亞地區、俄羅斯東部地區、澳大利亞的一些地區、西太平洋島嶼(塞班島)和巴布亞新幾內亞[4]。嚴重乙腦的臨床特征是高燒、頭痛、頸部肌肉僵硬、定向障礙、癲癇、癱瘓、昏迷,最終死亡。任何年齡的人群均能感染JE,但兒童更易感[5-6]。目前認為對于JE最有效的方法是免疫預防,現在有4種類型的JEV疫苗已被批準用于大規模免疫:分別是減毒活疫苗SA14-14-2、滅活小鼠腦源性疫苗、滅活Vero細胞培養疫苗和減毒嵌合疫苗[7]。盡管這些疫苗非常有效,但乙腦病例的發病率仍在增加[8],這表明需要建立治療乙腦感染的新療法。在病毒感染過程中,宿主蛋白和病毒的蛋白相互作用對病毒的吸附、穿入、復制及病毒感染等有著密切的相關性,了解這些作用對于JEV的防制具有十分重要的作用。本文將近年來有關JEV蛋白和宿主蛋白之間的相互作用機制進行綜述,為后續相關領域研究提供參考。

1 JEV結構蛋白與宿主蛋白的相互作用

1.1 衣殼蛋白C與宿主蛋白的相互作用JEV C蛋白包含100個氨基酸殘基,具有富含螺旋的結構,并與其他黃病毒形成相似的穩定同源二聚體[9],在黃病毒生物學中起著至關重要的作用,這種多功能蛋白可能會成為新的抗病毒藥物開發的目標。在病毒生命周期中,C蛋白亞基組裝形成核衣殼,而病毒核酸是由衣殼包裹。除了這種經典的結構作用之外,C蛋白與病毒復制周期中的其他重要功能也密切相關[10]。宿主對C蛋白的酶活性也可能影響毒力,根據對JEV的研究,宿主蛋白酶組織蛋白酶L在高度保守的殘基Lys18、Arg19和C蛋白之間相互作用,切割C蛋白才能使病毒正常復制。另外衣殼C蛋白與幾種宿主蛋白相互作用,包括和相關蛋白6 (DAXX)誘導細胞凋亡,以及與核心組蛋白作用后通過破壞核小體介導轉錄[11]。除存在于細胞質中外,JEV C蛋白還可被核定位序列引導轉運到細胞核中并指導病毒復制。C蛋白的核定位與核仁磷蛋白B23密切相關,它們相互作用的關鍵位點是C蛋白的核定位基序。該基序突變導致C蛋白無法與B23結合,最終C蛋白定位不準確導致病毒復制受到抑制。另外Jab1是COP9信號體(CSN)復合體的第5個亞基,Jab1可通過結合病毒C蛋白并調節C蛋白的降解來參與病毒的復制。JEV C蛋白還通過與Caprin-1蛋白結合來抑制應激顆粒SG的形成,促進病毒復制和翻譯[12]。

1.2 膜蛋白pr M/M與宿主蛋白的相互作用JEV pr M蛋白主要存在于不成熟的病毒中,是M蛋白的前體蛋白。研究表明pr M/M和E蛋白在黃病毒的進入、組裝和分泌中發揮重要作用[13],并且pr M蛋白可能與E蛋白的裝配、折疊以及定位等有關。病毒中的pr M/M蛋白保守區域主要參與病毒顆粒的組裝和分泌,DE WISPELAERE等[14]研究發現該區域被取代后會導致病毒的分泌減少。病毒在感染宿主時pr M蛋白會被細胞的furin蛋白酶切割成非糖基化的M蛋白和糖基化的pr蛋白肽,M蛋白僅與pr M的C末端有關,參與病毒感染過程。被furin蛋白酶切割的pr M會產生感染性顆粒,含有未切割pr M的未成熟顆粒不能進行膜融合并釋放到細胞外環境。但是furin蛋白酶介導的pr M蛋白裂解通常是不完全的,可以檢測到未成熟、部分成熟和成熟的細胞外顆粒的混合物,平衡的分解會影響病毒的復制或毒力[15]。目前為止對于pr M/M蛋白與宿主蛋白相互作用的了解僅有被furin蛋白酶切割,要了解得更深入尚需進一步研究。

1.3 E蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV是通過內吞作用進入宿主細胞,所以病毒粒子的表面包膜(E)蛋白在介導病毒包膜與內體膜在低pH值下融合的過程中起核心作用[16]。研究表明E蛋白與黃病毒進入、組裝和釋放密切相關。硫酸乙酰肝素、非整聯蛋白 DC-SIGN(CD209)和非整聯蛋白 L-SIGN(CD209L)作為病毒黏附因子,可以通過與病毒E蛋白相互作用介導病毒的入侵和感染[17]。在進入和釋放宿主細胞期間,E蛋白要經歷廣泛的構象變化。在JEV中,E蛋白有3個結構域DⅠ、DⅡ和DⅢ,DⅠ和DⅢ之間的保守組氨酸(His323)是關鍵的pH傳感器,His323的質子化能引發E蛋白的大規模構象重排以及病毒和內體膜的融合。包膜E蛋白是一種典型的Ⅱ類膜融合蛋白,與M蛋白一起通過跨膜螺旋錨定到脂質雙層包膜上形成病毒顆粒的外殼,通過其構象的重排融合病毒和內體膜從而形成一組蛋白質三聚體,其中融合肽(FP)與內體膜相互作用引發融合[18]。已經有研究表明,E蛋白與JEV等黃病毒的毒力密切相關,當JEV中的E蛋白發生突變會減弱病毒毒力。在BHK細胞中,JEV E蛋白被證實可與糖胺聚糖相互作用,而糖胺聚糖與蛋白的結合可促進病毒吸附和感染。另外葡萄糖調節蛋白78 (GRP78)是已被確定為與哺乳動物細胞中JEV E蛋白DⅢ區域(ED3)相互作用的宿主蛋白,在病毒感染細胞后兩者相互作用共同調節病毒復制,還參與其向質膜的轉運,但確切的機制尚不清楚[19]。另外DAS等[20]用生物信息學軟件預測E蛋白的RGD區與Neuro2A 細胞上熱激蛋白Hsp70的539位的亮氨酸可形成穩定的相互作用狀態,表明Hsp70可以作為Neuro2A細胞上JEV的受體,由此可見E蛋白與宿主蛋白相互作用在病毒感染過程中扮演了重要角色。

2 JEV非結構蛋白與宿主蛋白的相互作用

2.1 NS1蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS1蛋白是病毒復制中的關鍵蛋白,NS1作為單體或膜結合蛋白位于細胞膜中,在細胞質中或作為六聚體(分泌蛋白)位于細胞外。細胞內NS1是病毒復制中的關鍵保守蛋白,是合成正鏈和負鏈病毒RNA以及形成內質網相關復制復合體所必需的,在誘導宿主免疫應答中也具有重要作用。病毒復制過程中與多種宿主分子相互作用,從而幫助病毒復制、翻譯和病毒粒子增殖等[21- 22]。WANG等[23]研究表明,在JEV感染時NS1主要與波形蛋白、異質核核糖核蛋白K(hnRNP K)相互作用后促進病毒復制,并且NS1與細胞波形蛋白和hnRNP K共定位,在病毒生命周期中有重要的作用。NS1發生核糖體-1移碼時會產生NS1′,對病毒增殖也有重要作用。HAX1蛋白即造血和淋巴細胞限制性細胞內蛋白HS1相關蛋白X1,是一種具有多種功能泛素化表達的蛋白。其功能與細胞生存力,細胞遷移和控制癌癥進展有關,病毒感染時NS1可與HAX1的203～279aa區域發生互作,在病毒的生命過程中發揮作用,但具體的作用機制還有待進一步研究[24]。

2.2 NS2A蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS2A為疏水跨膜蛋白,主要參與JEV復制,還與病毒組裝密切相關[25]。NS2A 166位氨基酸對JEV的體外增殖和組織嗜性有重要作用[26]。三基序(TRIM)蛋白通過其E3連接酶活性直接降解病毒蛋白或通過促進宿主先天免疫間接發揮其抗病毒活性,參與各種細胞過程并在宿主抗病毒功能中發揮重要作用。TRIM52是一種新型抵抗JEV感染的TRIM蛋白。FAN等[27]研究表明TRIM52可通過與JEV NS2A 直接的物理相互作用并誘導NS2A泛素化,通過蛋白酶途徑導致NS2A降解從而抑制病毒增殖。目前和NS2A相互主要的宿主蛋白研究較少,但TRIM52和NS2A相互作用能抑制病毒增殖,可見NS2A有可能成為降低JEV感染的新方向。

2.3 NS2B蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS2B蛋白是一種跨膜蛋白,與翻譯后蛋白質加工和病毒組裝密切相關。NS2B作為NS3蛋白功能的輔助因子,通過促進蛋白酶活性來加工基因組編碼的多蛋白,可與自身和包括NS2A、NS4A、NS4B、NS3蛋白,以及和其他膜蛋白相互作用[28]。信號肽酶復合物亞基1 (SPCS 1)是微粒體信號肽酶復合物的一個組成部分,負責切割許多分泌蛋白和膜相關蛋白的信號肽,對翻譯后蛋白質加工和病毒組裝十分重要,之前有報道SPCS 1對于JEV的復制是必不可少的[29]。MA等[30]首次證明宿主因子SPCS 1與JEV NS2B蛋白的兩個跨膜結構域NS2B(1～49)和NS2B(84～131)相互作用影響病毒復制。參與黃病毒的病毒粒子組裝出芽和釋放到內質網(ER)腔,從而影響JEV蛋白的翻譯后加工和病毒粒子的組裝。但病毒組裝過程的細節復雜,要完全了解還需要更多的研究。

2.4 NS3蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV的非結構蛋白3 (NS3) 是一種具有619個氨基酸殘基的多功能蛋白,在病毒前體多蛋白的加工和病毒基因組RNA的復制中起重要作用。在JEV感染的細胞中NS3與微管和腫瘤易感基因101蛋白相關,在病毒RNA包裝、病毒成分的細胞內運輸和病毒組裝中起重要作用[31]。 NS3蛋白與核受體結合蛋白(NRBP)特異性作用,在核內共定位并影響病毒復制。白細胞介素增強子結合因子2 (ILF2)是一種組成型表達并定位于細胞核的染色質相互作用蛋白。ILF2與白細胞介素增強子結合因子3 (ILF3)形成穩定的異二聚體,并在細胞核中T細胞活化期間調節IL-2基因的轉錄,ILF2和ILF2/ILF3復合體是參與microRNA生物合成、RNA轉錄、剪接、mRNA翻譯、DNA斷裂修復、細胞增殖和凋亡的重要調節因子[32-36]。ILF2也是一種重要的參與病毒復制過程的宿主細胞蛋白[37-38]。CUI等[39]研究表明在JEV感染過程中,NS3蛋白與ILF2相互作用,并且這種相互作用不是由DNA或者RNA介導的,共同參與JEV生命周期并抑制JEV復制。另外JEV NS3是一種多功能蛋白,也能與JEV NS2B和NS4A相互作用,起解旋酶、蛋白酶和核苷三磷酸酶的作用,與NS5和dsRNA一起形成病毒復制酶復合物,并在病毒復制和病毒組裝中發揮重要作用[40-42]。

2.5 NS4A蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS4A蛋白是一種高度疏水的16 kDa跨膜蛋白,在病毒復制中起著至關重要的作用,其與病毒復制復合物定位有關,可誘導宿主膜改變[43]。NS4A和細胞波形蛋白中間絲之間的相互作用促進復制復合物(RC)的形成。NS4A也可與兩種定位在線粒體中的宿主蛋白相互作用,其中一種蛋白質是PTEN誘導的激酶1(PINK 1),另一種是以其在線粒體自噬中的作用而聞名的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。病毒感染會導致PINK 1表達下調,有絲分裂吞噬通量增加同時線粒體質量下降,干擾JEV誘導的線粒體片段化和有絲分裂限制病毒繁殖[44]。病毒感染哺乳動物細胞期間,JEV非結構蛋白NS4A在線粒體動力學中發揮重要作用。JEV NS4A和PINK 1相互作用可能在JE相關的神經病理學中發揮重要作用,然而這種相互作用對乙腦疾病表現的確切影響需要進一步的研究來闡明。

2.6 NS4B蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS4B是一種小的完整膜蛋白(約27 kDa),ER應激傳感器蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)在急性或長期ER應激下誘導細胞凋亡,主要與PERK發生互作。NS4B具有的基序包括LIG-SH2(氨基酸(aa)64～67)、LIG-FHA(aa 162～168和aa 192～198)、LIG-WD40(aa 7～12、aa 31～36、aa 197～216和aa 249～253),可分別結合PERK內的SH2結構域、FHA結構域和WW結構域。且NS4B中的LIG-FHA和LIG-WD40結構域都需要誘導PERK二聚化,說明JEV NS4B是通過不同的基序同時與它們相互作用將兩個PERK分子拉到一起,PERK失活可減少JEV感染期間的腦細胞損傷和腦炎。此外,在小鼠Neuro-2a細胞中JEV NS4B的表達會使PERK誘導腦炎,表明JEV主要通過其NS4B激活PERK引起腦炎[45]?？梢妼τ贘EV引起的腦炎可通過誘導PERK失活從而得到緩解,這將有可能成為治療JEV引起腦炎的一種新型治療方法。

2.7 NS5蛋白與宿主蛋白的相互作用在非結構蛋白中,黃病毒的NS5在先天免疫逃避中起關鍵作用。NS5是最大的黃病毒蛋白,含有N端甲基轉移酶(MTase)和C端聚合酶RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp),分子內NS5具有完整的MTase和RdRp界面,由兩部分組成:六殘基疏水網絡和GTR接頭[46]。MTase-RdRp界面和GTR接頭區域是RdRp延伸、起始和黃病毒復制所必需的[47]。PRYOR等[48]研究表明輸入蛋白α/β(importin α/β)與NS5在核內共定位影響病毒的復制。另外NS5和末端順式作用RNA之間的合作控制線性和環狀基因組構象的平衡,并允許有效的病毒復制[49-51]。WANG等[52]通過酵母雙雜交法篩選小鼠腦cDNA文庫,發現JEV NS5蛋白可與HSP40的同源蛋白Hdj2相互作用,對病毒復制起到積極的調控作用。KAO等[53]研究表明JEV NS5與羥?；o酶A脫氫酶α(HADHα)和羥?；o酶A脫氫酶β(HADHβ)相互作用,HADHα和HADHβ是參與LCFA β氧化的酶復合物MTP的兩個亞基。這種相互作用損害了LCFAβ氧化,增加了細胞因子的產生,并促進JEV的發病機制。NS5的M19殘基參與其與MTP的相互作用,與野生型JEV相比,具有NS5-M19A突變的重組JEV更不能阻斷LCFAβ氧化,誘導更低水平的細胞因子產生,并表現出更低的神經毒性和神經侵襲性。

3 小結與展望

JE在全球的廣泛傳播已經對世界各國的畜牧業和人類健康造成了嚴重的危害。同時,由于其致病機制十分復雜,具有持續性感染的典型特征,使其防治極其困難。研究表明,JEV蛋白與宿主細胞蛋白相互作用,對病毒入侵、復制、膠質細胞增殖、神經元凋亡、炎性反應、IFN抵抗與誘導宿主保護性免疫等均有重要影響。因此,分析JEV與宿主蛋白的相互作用不僅對其致病機制的研究至關重要,而且為新型抗病毒藥物和新型疫苗的研究提供了新的思路。病毒蛋白與宿主細胞蛋白之間的相互作用是介導病毒進入細胞內引起動物機體感染的關鍵。蛋白質作為生命活動的主要承擔者,各種復雜的生命活動都離不開蛋白質的參與,但人體的大部分生命活動不能僅僅依靠單一的蛋白質調節,必須依靠蛋白質之間的相互作用才能維持機體正常的生命活動,因此研究蛋白質之間的相互作用就顯得尤為重要。對于一些研究背景不明確的蛋白質,可以研究其相互作用蛋白的功能及其對生物體的影響,分析靶蛋白的相關作用,為未知蛋白質的研究提供思路。目前,雖然國內外學者對JEV的研究取得了一定進展,但由于病毒與宿主細胞相互作用的復雜性,對其具體致病機制的了解仍然有限。與同屬病毒相比,仍有巨大的研究空間。本文從蛋白相互作用的角度出發,綜述了與JEV蛋白相互作用的宿主蛋白以及病毒感染宿主的致病機制,可為JE病的診斷、防制提供一定的參考。