納米氧化鋅對17℃保存豬精子質量的影響

胡啟蒙,張云秋,黃 琴,高智清

(廊坊師范學院 生命科學學院 河北省動物多樣性重點實驗室,河北 廊坊 065000)

人工授精技術通常用于畜牧業生產[1],人工授精所需要的精源通常使用17℃液體保存,其具有成本低、便于運輸以及不易污染等優點。但保存精子 會受到氧化應激和細菌感染損傷[2],特別是豬精子,因具有低膽固醇/磷脂比,對低溫和氧化刺激較敏感,更容易在保存中受到損傷[3],通常采用研發稀釋劑解決精子保存技術的瓶頸。目前,研究主要集中在外源添加抗氧化劑和抑菌劑,以減少精子損傷和維持精子正常功能。

納米技術是生物技術的一個新興領域,納米氧化鋅顆粒(ZnO NPs)是一種粒徑為1～100 nm的氧化顆粒,其具有抗氧化性、殺菌性和安全性等優異性能且在生物醫學領域已得到證實[4],并廣泛應用于畜牧業生產[5],用于精子保存時可緩解精子在冷凍和解凍過程中造成的損傷。冷凍保存牛、雞精子添加納米氧化鋅(ZnO)可提高解凍后精子質量[6]。已知鋅在睪丸發育、精子發生、獲能和精子運動中發揮重要作用[7]。

哺乳動物成熟精子是一種高度分化的細胞[8],成熟后幾乎無新蛋白質生成,因此翻譯后修飾成為精子功能的重要調控機制,其中蛋白磷酸化修飾是最重要的調節方式,在精子運動和能量代謝等過程中發揮重要作用[9]。線粒體是精子成熟后極少數被保留下來的細胞器之一,是產生ATP的主要場所,為精子運動提供能量保障[10]。

ZnO在豬精子保存過程中的效果和作用機理還未完全了解,本研究擬從精子質量(活力和膜完整性)、抗氧化層面分析ZnO NPs對保存豬精子全蛋白和亞組分(骨架和膜)蛋白的磷酸化修飾,探討ZnO NPs對保存豬精子氧化應激緩解作用機理及對精子質量和蛋白磷酸化保護效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試精子取自成年健康雄性杜洛克豬,精子活力良好(>70%)。用Androstar Plus稀釋液按1∶2的比例稀釋精液,700×g離心5 min,去掉1/3的上清液后,將剩余的精液重懸于Androstar Plus稀釋液中,得到總體積為50 mL、精子終濃度為1×107個/mL的稀釋精液。

1.2 主要試劑PKA底物磷酸化檢測抗體購自CST公司,對應的二抗、熒光二抗購自上海碧云天生物技術有限公司。ZnO NPs(30～80 nm)購自南京先豐納米材料科技有限公司?？偝趸锲缁?SOD)和微量丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 溶液配制精子未獲能培養液(pH7.4)配方為 2.7 mmol/L KCl、1.5 mmol/L KH2PO4、8.1 mmol/L NaH2PO4、137 mmol/L NaCl、5.55 mmol/L葡萄糖溶液和2 mmol/L丙酮酸鈉溶液。

1.4 試驗設計

1.4.1試驗一 在5 mL稀釋精液中添加不同質量濃度(0,20,50,100,200 mg/L)的ZnO NPs,在17℃恒溫箱中保存,每12 h輕輕搖動溶液,避免精子沉淀。分別于保存1,3,5,7 d后檢測0,50 mg/L處理組精子總抗氧化能力(T-AOC)和MDA含量;保存7 d后,收集各處理精子加入適量未獲能培養液,在37℃、5% CO2細胞培養箱中培養2 h,用于檢測各處理組(0,20,50,100,200 mg/L)精子質量(活力、膜完整性)和蛋白磷酸化。

1.4.2試驗二 在100 mg/L ZnO NPs處理下添加1 mmol/L dbcAMP或0.1 mmol/L H-89,17℃恒溫箱中保存7 d后,收集精子加入適量培養液,在37℃、5% CO2細胞培養箱中培養2 h后檢測蛋白磷酸化。

1.5 精子質量檢測

1.5.1精子活力 在光學顯微鏡下,使用37℃預熱的精子計數板,觀察各組200個精子的運動情況,統計前進運動精子的數量,前進運動精子率=(前進運動精子數量/200)×100%。

1.5.2質膜完整性 采用考馬斯亮藍染色法檢測精子膜的完整性。質膜完整的精子頂體中含蛋白質成分可被考馬斯亮藍染液染成藍色,質膜不完整的精子頭部則不會被染色。用光學顯微鏡觀察200個精子的染色情況,膜完整率=(染色精子數/200)×100%。

1.6 T-AOC活性測定使用T-AOC檢測試劑盒,通過比色法測定,保存豬精液T-AOC活性,比色波長為520 nm,相關操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.7 MDA含量測定使用MDA含量檢測試劑盒,通過比色法測定,保存豬精液MDA含量,比色波長為532 nm,相關操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.8 蛋白質免疫印跡

1.8.1蛋白的分離和定量 全蛋白提取:每組樣品4℃、12 500×g離心5 min,用4℃ PBS清洗細胞沉淀,離心收集精子細胞,加入200 μL的蛋白裂解液,煮沸4 min。收集上清液后加入10% β-巰基乙醇沸水浴3 min,收集上清液即為蛋白樣品。Triton溶解性和非溶解性蛋白提取:在精子樣品中添加0.1% TritonX-100緩沖液,采用渦旋(5 min)和冰浴(5 min)循環30 min充分混合樣品,低溫高速離心,分離出Triton溶解性蛋白(上清)和Trtion非溶解性蛋白(沉淀),再加蛋白質裂解液得到蛋白樣品,裂解方法與全蛋白相同。

1.8.2SDS-PAGE和免疫印跡法 蛋白質樣品經12%丙烯酰胺凝膠電泳分離,使用轉移電槽(10 V,12 h)轉移到PVDF膜上。用1% BSA的TBST溶液封閉1 h后,將PVDF膜與一抗PKA底物磷酸化(1∶10 000)在4℃下孵育4 h,然后用T-TBS緩沖液洗滌。將PVDF膜與相應的二抗在4℃下孵育2 h,再將PVDF膜用ECL孵育1 min,隨后于暗室中曝光,用Bio-Rad凝膠成像系統拍照。

1.9 免疫熒光檢測將300 μL精子樣品懸浮于10%甲醛溶液中,4℃固定至少12 h。將樣品洗滌3次后均勻涂于載玻片上,在室溫下風干2 h。用3.7%甲醛固定20 min,用滲透液滲透10 min,再用封閉液封閉2 h,每步驟間用洗脫液洗滌5次,每次3 min。精子樣本用p-PKA抗體(1∶5 000)在4℃下孵育過夜。洗脫液洗滌一抗后,使用對應的熒光二抗(1∶2 000)在4℃下孵育2 h。通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.10 數據分析應用Image J圖像分析軟件檢測蛋白免疫印跡的灰度值,用Excel錄入數據,采用SPSS 20軟件對數據進行單因素方差分析并對組間差異進行多重比較,差異顯著水平設定為P<0.05。

2 結果

2.1 ZnO NPs對保存精子活力和膜完整性的影響由表1可以看出,ZnO組的精子活力與對照組無顯著性差異,而50,100,200 mg/L ZnO NPs處理組精子膜的完整性顯著高于對照組(P<0.05)。

表1 不同質量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子活力和膜完整性的影響 %

2.2 ZnO NPs對保存精子抗氧化能力的影響如表2所示,與對照組相比,50,100,200 mg/L ZnO NPs處理組精子的T-AOC活性顯著提高(P<0.05)。ZnO NPs處理組的精子MDA均顯著低于對照組(P<0.05)。在保存期間,以50 mg/L ZnO NPs處理為例進行選擇天數檢測發現,3 d后,ZnO NPs處理組的T-AOC活性顯著高于對照組(表3),MDA含量顯著低于對照組(表4)。

表2 不同質量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子T-AOC活性和MDA含量的影響

表3 不同保存時間下ZnO NPs對17℃保存豬精子T-AOC活性的影響 U/mg

表4 不同保存時間下ZnO NPs對17℃保存豬精子MDA含量的影響 μmol/L

2.3 ZnO NPs對保存精子PKA底物磷酸化的影響全蛋白可分為Triton溶解性蛋白(膜蛋白)和Triton非溶解蛋白(骨架蛋白)。由圖1可以看出,100,200 mg/L ZnO NPs處理組精子全蛋白磷酸化灰度值顯著高于對照組(P<0.05),其他處理與對照差異不顯著。豬精子蛋白磷酸化免疫定位顯示,ZnO NPs處理組的精子鞭毛中段和主段蛋白質磷酸化修飾增強(圖2),這與蛋白免疫印跡結果一致。膜蛋白和骨架蛋白的磷酸化修飾變化趨勢與全蛋白質相同,且ZnO NPs處理組的灰度值均顯著高于對照組(P<0.05,圖3,4)。

圖1 不同質量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子全蛋白磷酸化影響的免疫印跡分析

A～E.ZnO NPs質量濃度分別為0,20,50,100,200 mg/L

圖3 不同質量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子Triton不溶性蛋白磷酸化影響的免疫印跡分析

2.4 ZnO NPs對cAMP/PKA通路的影響由圖5可知,ZnO NPs+H-89處理組的蛋白磷酸化水平顯著低于ZnO NPs組(P<0.05);ZnO NPs+dbcAMP處理組的蛋白磷酸化水平顯著高于ZnO NPs組(P<0.05)。添加ZnO NPs不影響dbcAMP或H-89調節精子的磷酸化,表明ZnO NPs并不干擾cAMP/PKA通路,而cAMP/PKA通路是蛋白磷酸化最重要的信號通路。p-PKAs在豬精子中的免疫定位進一步證實了免疫蛋白印跡結果(圖6)。

圖4 不同質量濃度ZnO NPs對Triton溶解性蛋白磷酸化影響的免疫印跡分析

1.100 mg/L ZnO NPs;2.100 mg/L ZnO NPs+1 mmol/L dbcAMP;3.對照;4.100 mg/L ZnO NPs+0.1 mmol/L H-89

A.100 mg/L ZnO NPs;B.100 mg/L ZnO NPs+1 mmol/L dbcAMP;C.對照;D.100 mg/L ZnO NPs+0.1 mmol/L H-89

3 討論

17℃保存動物精子是一種簡單、經濟、有效的方法,廣泛應用于畜牧業生產中。但此技術由于細菌感染和氧化損傷的制約,只能有效儲存約3 d[2]。在豬精子的保存過程中會產生活性氧(ROS)的積累,對精子功能造成損害[2]。研究發現,氧化應激是多種雄性生殖障礙的誘導因素,可通過抑制線粒體活性、降低精子活力或增加豬精子細胞膜的脂質過氧化的方式影響精子功能的正常發揮[11]。在精子保存稀釋液中添加抗氧化物質可以消除精子中的MDA,減輕線粒體氧化磷酸化電子傳遞鏈的氧化損傷。ZnO NPs被證明可以保護精子膜和線粒體免受氧化應激,而抗氧化能力的提升可以明顯改善精子在保存過程中的進行性活力和質膜完整性。

使用弱酸性環境保存精液可以抑制精子的運動,使其處于可逆的靜止狀態,減少能量消耗,不失去受精的能力[12]。添加ZnO NPs后,精子活力保持穩定狀態,未誘導精子運動加速,這有利于精子的有效保存。哺乳動物的精子必須通過糖酵解和/或氧化磷酸化途徑來產生ATP,以維持鞭毛的運動[10]。氧化磷酸化主要發生在精子中段的線粒體,糖酵解主要發生在精子的鞭毛主段。糖酵解所需的關鍵酶多集中于纖維鞘上。ZnO NPs可提高保存精子的膜完整性,對維持線粒體正常功能和糖酵解功能具有重要意義。該功能可能與ZnO NPs具有大的表面積、能夠清除ROS、降低MDA誘導的氧化應激有關[13]。本研究發現,ZnO NPs提高了保存精子的T-AOC,T-AOC的提高可能與精子膜的完整性有關。

通過分析精子磷酸化發現,ZnO NPs可以保護細胞膜蛋白或細胞骨架蛋白的功能蛋白磷酸化。成熟精子是一種高度分化的細胞,其功能的調控主要通過蛋白翻譯后修飾,其中蛋白質磷酸化是重要方式之一,蛋白磷酸化也成為反應精子功能的重要指標[14]。通過分析蛋白磷酸化修飾程度和位置,可為了解外源ZnO NPs對精子保護作用的分子機制及其在生殖技術中的應用提供理論基礎。據報道,精子在低溫保存后細胞骨架結構變化[15]。研究發現,冷凍保存后精子的總肌動蛋白的表達顯著下降,肌動蛋白的位置改變,精子的體積和結構也發生改變[16]。受精前,精子需在雌性生殖道中獲能,肌動蛋白聚合是參與哺乳動物精子獲能的重要過程。肌動蛋白通常在尾部區域聚合,然后發展到頭部區域,蛋白磷酸化可以調節肌動蛋白聚合[17]。同時,肌動蛋白在哺乳動物精子質膜和頂體外膜間的定位,在精子獲能和頂體反應中起著關鍵作用[18]。

本研究發現,ZnO NPs可以保護豬精子膜的完整性。精子頂體含有多種水解酶,當與卵細胞融合時溶解卵細胞的保護層,促進精子的融合和受精[19]。保持精子頂體的完整性是確保精子完成復雜的受精過程的關鍵步驟。精子的長期儲存需要考慮到豬精子具有脆弱和敏感的結構,具有低膽固醇/磷脂比,精子的結構完整性決定精子功能的完整性[20]。通過分析精子膜蛋白的磷酸化狀態發現,添加ZnO NPs對精子膜有較強的保護作用。

本研究分析了蛋白磷酸化和cAMP/PKA調控。調控精子蛋白磷酸化的信號通路是復雜而多樣的,研究最廣泛的途徑是cAMP/PKA信號通路[9]。在保存稀釋液中添加ZnO NPs并不影響cAMP/PKA調控精子蛋白磷酸化的能力。精液保存中補充抗氧化劑保護精子是一個重要的研究內容。本試驗利用精子評估了ZnO NPs作為一種替代型抗氧化劑的安全性,ZnO NPs其特有的物理和化學特性,使得外源性添加ZnO NPs可有效提高保存精子抗氧化能力,提升保存精子的膜完整性,保證了精子蛋白磷酸化正常修飾作用。

通過外源添加抗氧化劑來保護精子免受氧化應激是當前輔助生殖技術的重要研究課題。本研究結果表明,ZnO NPs作為公豬精液稀釋劑的補充物是安全可行的,有助于更全面地了解ZnO NPs對精子保護作用的分子機制。