HLA-E與oHSV2 VP5蛋白相互作用研究

姚若一, 范嘉琦, 肖 雄, 周 芹, 汪 洋, 胡 翰, 劉濱磊

(湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北 武漢 430068)

溶瘤病毒(oncolytic virus,OVs)療法是一種癌癥免疫治療方式。溶瘤病毒可以直接原位感染和裂解腫瘤細胞,誘導腫瘤內的急性炎癥,并提供病原體相關分子模式(PAMPs)和危險相關分子模式(DAMPs),其感染的腫瘤細胞的死亡會在這種免疫刺激環境中釋放腫瘤相關抗原(TAAs),從而促進免疫細胞流入、抗腫瘤免疫反應和腫瘤免疫環境的重構[1]。目前,已有多種病毒被用作溶瘤病毒載體,單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)由于其具有多種優勢而被廣泛應用、研究[2]。

oHSV2是在單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)標準毒株HG52的基礎上,敲除了ICP34.5和ICP47,插入編碼人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF)的表達序列的新型溶瘤病毒。ICP34.5是一種神經毒性因子,可以抑制I型干擾素(IFN)反應,拮抗非分裂細胞內的PKR信號通路。ICP34.5的敲除提高了腫瘤細胞的選擇性,防止神經元的感染。ICP47可以阻斷TAP(與抗原加工相關的轉運體)的功能,從而阻止了受感染細胞向CD8+T細胞呈遞抗原。ICP47的敲除誘導了US11啟動子的早期激活,增加溶瘤病毒治療活性,還使健康細胞和腫瘤細胞都呈遞病毒抗原,抑制健康組織的感染,免疫介導破壞腫瘤細胞,選擇性繁殖溶瘤病毒。hGM-CSF可以促進樹突狀細胞的積累和成熟,改善腫瘤抗原呈遞并刺激強大的T細胞反應[3]。目前,其產品OH2注射液作為多適應癥單藥(NCT03866525)和聯合用藥HX008(NCT04616443)均正在進行臨床試驗。

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)是基因組中多態性最強的區域,并且富含編碼具有免疫學意義的分子的基因[4]。人的MHC被稱為人類白細胞抗原(human leucocyte antigens,HLA)基因復合體,可分為HLAⅠ、HLAⅡ、HLAⅢ[5]。HLAⅠ類基因通常分為兩類:經典類(Ⅰa類),包括HLA-A、HLA-B和HLA-C,具有明顯的多態性;非經典類(Ⅰb類),包括HLA-E、HLA-F、HLA-G等,不顯示或僅顯示有限的多態性[6]。HLA Ⅰ a分子可被殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immnoglobulin-like receptor,KIR)識別,而HLAⅠb分子主要通過同源二聚體NKG2D和異二聚體CD94-NKG2受體介導識別[7]。

在腫瘤細胞表面,HLA Ⅰ a類分子的表達通常下調甚至丟失,從而逃避細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對其的識別和特異性殺傷。理論上,自然殺傷(NK)細胞可以殺傷缺乏HLAⅠ分子的腫瘤細胞。但實際上,它們之所以能逃避NK細胞的攻擊,此現象可能與HLA Ⅰ b分子在腫瘤細胞表面的表達有關[8]。

人類白細胞抗原E(HLA-E)是功能和作用途徑較為明確的HLAⅠb類分子,具有組織分布狹窄但細胞表面表達較低的特征,幾乎在所有成人細胞表面低水平表達。不過,已有多項研究證實了HLA-E在許多類型的人類腫瘤細胞的表面過表達。HLA-E是CD94/NKG2A的主要配體,該受體在來自外周血的超過50%的CD56bright或CD56dimNK細胞及CD8+T細胞的一些亞群上表達[9]，是一種抑制性受體。HLA-E與CD94/NKG2A結合后,SHP-1磷酸酶被招募到NKG2A的酪氨酸磷酸化的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM),然后將抑制信號傳遞給免疫效應細胞,最終產生抑制作用[10]。因此,HLA-E在腫瘤細胞上的上調表達,對NK細胞和CD8+T細胞發揮抗腫瘤功能是不利的。

前期研究發現,UV-oHSV2的處理可以使BGC823、LoVo和U87MG細胞上的HLA-E上調表達。在體外實驗中,經過HLA-E抗體預處理的BGC823細胞被殺傷效果更明顯。在皮下荷瘤裸鼠瘤內給藥模型,和腹腔荷瘤裸鼠腹腔給藥模型中,藥物中添加HLA-E抗體均可以減小小鼠腫瘤體積,并延長小鼠的生存期。基于此,本文進行oHSV2與HLA-E的相互作用研究,并運用激光共聚焦實驗進行初步驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

溶瘤病毒oHSV2由本實驗團隊基因改造,并進行生產、純化。293T細胞,BGC823細胞由本實驗團隊保存。大腸桿菌DH5α感受態細胞,BL21(DE3)感受態細胞由本實驗團隊制備。質粒載體pGEX-6p-1、EGFP-C1由本實驗團隊保存,pCMV-N-DsRed購于碧云天生物。

總RNA提取、通用型DNA純化回收、無內毒素質粒小提中量試劑盒均于TIANGEN購買。限制性內切酶于NEB購買。非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒、2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)于Vazyme購買。GST標簽蛋白純化試劑盒于碧云天生物購買。HLA-E抗體、HRP標記的山羊抗兔二抗于proteintech購買。DAPI、4%多聚甲醛于biosharp購買。

1.2 細胞培養、總RNA提取

細胞均用DMEM/F12(添加10%FBS)培養基,在5% CO2,37℃的細胞培養箱中培養。總RNA提取步驟依據試劑盒說明書。

1.3 質粒構建

目的基因PCR體系配制及反應程序依據說明書。所用到的引物見表1。

表1 引物信息

質粒載體雙酶切,反應體系:質粒2000 ng,內切酶各4 μL,cutsmart buffer 20 μL,補加DEPC水至200 μL。反應條件:37℃,2 h。

以上體系用試劑盒回收后進行同源臂連接。連接反應產物轉化DH5α感受態細胞,涂板。第二天挑取單菌落,進行菌落PCR鑒定。

1.4 GST-HLA-E融合蛋白的表達與純化

將pGEX-6p-1-HLA-E質粒轉化DE3感受態,以1∶100接種于LB液體培養基(含100 mg/L Amp),37℃搖菌;然后加入IPTG,20℃低溫誘導表達過夜。接下來4℃離心收集菌體,超聲破碎15 min;再次4℃離心后的上清使用GST標簽蛋白純化試劑盒進行純化。

1.5 質粒提取、轉染及總蛋白提取

質粒提取步驟依據試劑盒說明書。

293T細胞在六孔板中培養。當細胞密度達到70%左右時,更換細胞培養液,均勻加入轉染體系(質粒2.5 μg,lipo8000轉染試劑4 μL,MEMα培養基補至125 μL),培養24 h。棄培養基,用RIPA(強)裂解液冰上裂解細胞20 min,轉至1.5 mL EP管,13000 r/min,4℃離心15 min收集上清,加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸變性。

1.6 western blot

蛋白樣品經電泳分離后,使用半干法轉膜(電壓15 V),將蛋白轉到NC膜上。然后膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗(1∶1000)4℃孵育過夜,二抗(1∶10000)室溫孵育1 h。最后在膜上滴加ECL顯色液進行顯影。

1.7 激光共聚焦實驗

293T細胞在玻底培養皿中培養,pCMV-N-DsRed-HLA-E質粒和EGFP-C1-UL19質粒、pCMV-N-DsRed-UL19質粒和EGFP-C1-HLA-E質粒分別1∶1共轉染。轉染24 h后,用4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min,再用DAPI(1 μg/mL)室溫避光染核10 min。最后加入抗熒光淬滅劑,在激光共聚焦顯微鏡下觀察VP5與HLA-E的共定位情況。

2 結果

2.1 原核表達載體的構建

提取BGC823細胞總RNA,反轉錄為cDNA,以cDNA為模板擴增HLA-E基因(1～600 bp),瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增出的條帶在約600 bp處,與目的基因大小相符(圖1)。然后將回收的DNA與原核表達載體pGEX-6p-1連接,連接反應產物轉化DH5α感受態細胞,挑取11個Amp抗性菌落為模板進行菌落PCR鑒定,均擴增成功,條帶位置與目的基因相符(圖2)。再從中挑取3個送公司測序,測序得到的基因序列同GenBank中發布的標準序列一致。提取質粒后進行雙酶切鑒定(圖3),證明pGEX-6p-1-HLA-E質粒構建成功。

圖1 PCR擴增HLA-E基因

圖2 菌落PCR篩選pGEX-6p-1-HLA-E重組子

圖3 pGEX-6p-1-HLA-E(EcoR Ⅰ、Not Ⅰ)雙酶切

2.2 GST-HLA-E融合蛋白的純化

破碎后的上清與GSH-瓊脂糖珠孵育,收集孵育后的上清和洗脫(共4次)下來的蛋白樣品,加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性,然后通過SDS-PAGE分離。考馬斯亮藍染液染色(圖4)和western blot(圖5)顯示的結果一致,GST-HLA-E蛋白在45 kDa上方。

圖4 考馬斯亮藍染色

圖5 western blot驗證純化蛋白HLA-E的表達

2.3 GST pull-down及質譜鑒定

先使純化后的GST-HLA-E蛋白結合在GSH-瓊脂糖珠上,然后與oHSV2(RIPA強裂解液裂解)蛋白孵育,洗掉其中不與HLA-E結合的雜蛋白,保留剩余的樣品。質譜分析結果為oHSV2的主要衣殼蛋白VP5與HLA-E相互作用(圖6)。

圖6 質譜分析結果

2.4 HLA-E熒光質粒構建

PCR擴增見2.1。回收的DNA產物與載體EGFP-C1、pCMV-N-DsRed連接,連接反應產物轉化DH5α感受態細胞。挑取10個Kana抗性菌落為模板進行菌落PCR鑒定,均擴增成功(圖7)。各挑取3個重組子送公司測序,測序得到的基因序列同GenBank中發布的標準序列一致。提取質粒后,將質粒轉染293T細胞,然后在體視熒光顯微鏡下觀察,均發熒光(圖8),同時將細胞裂解取上清進行western blot分析,可以檢測到HLA-E(圖9),證明EGFP-C1-HLA-E、pCMV-N-DsRed-HLA-E質粒構建成功。

圖7 菌落PCR篩選EGFP-C1-HLA-E、pCMV-N-DsRed-HLA-E重組子

圖8 體視熒光顯微鏡下轉染HLA-E熒光質粒的細胞

圖9 western blot驗證熒光質粒HLA-E的表達

2.5 UL19熒光質粒構建

提取oHSV2病毒DNA,以其為模板PCR擴增UL19基因(1～1002 bp),瓊脂糖凝膠電泳結果如圖10所示。

圖10 PCR擴增UL19基因

將回收產物與載體EGFP-C1、pCMV-N-DsRed連接,連接反應產物轉化DH5α感受態細胞。各挑取10個Kana抗性菌落為模板進行菌落PCR鑒定,均擴增成功(圖11)。

圖11 菌落PCR篩選EGFP-C1-UL19、pCMV-N-DsRed-UL19重組子

各挑取3個重組子送公司測序,測序得到的基因序列同GenBank中發布的標準序列一致。提取質粒后進行雙酶切鑒定(圖12)。同時質粒轉染293T細胞,在體視熒光顯微鏡下看到均發熒光(圖13)。證明EGFP-C1-UL19、pCMV-N-DsRed-UL19質粒構建成功。

圖12 EGFP-C1-UL19(Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ);pCMV-N-DsRed-UL19(EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ)雙酶切

圖13 體視熒光顯微鏡下轉染UL19熒光質粒的細胞

2.6 激光共聚焦實驗驗證HLA-E與VP5蛋白相互作用

HLA-E和UL19熒光質粒1∶1共轉染293T細胞,細胞經過固定、染核處理后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結果顯示,無論質粒帶何種熒光標簽,熒光均在細胞質中分布,在熒光疊加后,可以觀察到HLA-E和VP5蛋白在細胞質中的共定位(圖14)。

圖14 激光共聚焦實驗驗證HLA-E與VP5蛋白相互作用

3 結論

已有研究報道HCMV(人巨細胞病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)也存在病毒感染引起HLA-E表達上調的現象。HCMV感染細胞后,通過其糖蛋白UL40產生的多肽與HLA-E結合,上調HLA-E在細胞表面的表達,然后通過CD94/NKG2A受體,從而逃脫NK細胞的裂解[11]。Nattermann等在HCV中也發現了類似的機制,HCV導致HLA-E上調,通過其與CD94/NKG2A的相互作用,從而抑制NK細胞的裂解功能[12]。但EBV(Epstein-Barr病毒)能夠產生一種多肽綁定HLA-E分子,破壞NKG2A的識別,導致NK細胞的激活[13]。我們前期也發現oHSV2在體外上調部分腫瘤細胞系表面HLA-E的表達水平。為了研究oHSV2是否也能與HLA-E結合,從而通過CD94/NKG2A調控NK細胞激活或抑制,本文應用GST pull-down和質譜技術篩選出了oHSV2的VP5蛋白(由UL19基因編碼)為HLA-E的相互作用蛋白,并進行了初步驗證。

HSV-1/HSV-2 UL19基因編碼的VP5蛋白是病毒的主要衣殼蛋白,是一種晚期(leaky-late)表達蛋白,在感染復制周期中晚期最高表達[14]。冷凍電子顯微鏡下觀察到HSV-2(MS株)衣殼結構由大約3000個蛋白質組成,分為3種類型:六鄰體(hexons)、五鄰體(pentons)和三聯體(triplexes)。六鄰體和五鄰體都包含VP5(六鄰體還包含VP26);三聯體包括VP23和VP19C。VP5蛋白形成了廣泛的分子間網絡,包括多個二硫鍵(總共約1500個)和非共價相互作用,與VP26蛋白和三聯體支撐衣殼穩定和裝配[15]。

我們截取UL19基因前1002 bp構建了紅/綠熒光質粒,與HLA-E的熒光質粒共轉染293T細胞,通過激光共聚焦顯微鏡的觀察,發現它們在細胞質中有共定位。但這只是初步的驗證,后期將進行免疫共沉淀(co-IP)和雙分子熒光互補(BiFC)實驗作進一步驗證。