Xpert MTB/RIF技術在肺結核患者結核分枝桿菌鑒定及利福平耐藥檢測中的應用價值

趙麗麗 許玲英 倪慧群 鐘東方

結核病是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的傳染性疾病，并通過空氣在人與人之間傳播。目前我國每年新發結核患者約90 萬，是全球結核病高發病率國家之一，結核防控形勢十分嚴峻［1］。結核病早期預防及時檢測、規范治療是關鍵，準確快速檢測結核病，包括涂片陰性結核病和耐藥結核病，對于改善患者預后提高治愈率、降低死亡率、降低耐藥性并減少結核病傳播至關重要。結核分枝桿菌培養通常被認為是MTB 診斷的金標準，也是比例法進行細菌藥敏檢測的第一步。然而，培養是一個相對復雜和緩慢的過程，其中固體培養通常需要2～4 周才能獲得結果，而液體培養也需要數天時間且容易受到污染。Xpert MTB/RIF 可同時檢測MTB 和利福平耐藥性，是目前臨床一線對肺結核早期發現、快速診斷的重要檢測方法，在結核病快速診斷以及耐藥結核規范治療過程中具有重要意義，世界衛生組織已經推薦該技術用于肺結核痰液標本檢測［2］。本文探討Xpert MTB/RIF 技術在肺結核病快速診斷及耐藥檢測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019 年5 月至2021 年5 月海鹽縣人民醫院596 例初診疑似肺結核患者痰液樣本。肺結核臨床診斷標準：痰涂片陽性，胸部X 線檢查與肺結核相符的病變，并符合下列條件之一：①伴有咳痰、咳嗽、咯血等可疑癥狀，②結核菌素試驗呈強陽性，③抗結核抗體檢查陽性［3］，臨床診斷結合病理學或病原學培養結果作為肺結核確診依據。納入標準：胸部影像學檢測類似肺結核特征，有相應癥狀，治療前可獲得合格痰標本。排除標準：標本污染，非肺結核或肺外結核患者。去除培養污染3 例，最終納入593 例。其中男356 例，年齡（60.2±16.9）歲；女237 例，年齡（55.4±16.6）歲。593 份標本分別做熒光染色鏡檢、Xpert MTB/RIF 檢測、液體法培養及培養陽性菌株結核菌鑒定和比例法藥物敏感性試驗。

1.2 方法 （1）儀器與試劑：Xpert MTB/RIF 系統及其配套試劑盒、痰標本處理液（美國Cepheid 公司），對硝基苯甲酸（PNB）培養基、噻吩-2-羧酸肼（TCH）培養基、金胺“O”熒光染液（珠海貝索生物技術公司），BACTEC MGIT320 系統及配套消化液、添加劑、培養基（美國BD 公司），結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒（杭州創新生物檢控技術有限公司）。（2）直接涂片熒光染色法：熒光染色將固定后的痰涂片用金胺“O”染液染色10 min 后水洗，再用酸性酒精溶液脫色1～2 min 后水洗，重復脫色至外觀無黃色為止，用復染液復染1 min后水洗待干鏡檢。熒光染色鏡檢結果分級報告標準參照《肺結核診斷WS 288-2017》。（3）Xpert MTB/RIF 檢測技術：前處理管加入1 mL 痰液和2 倍處理液，旋緊強力震蕩20 s 后室溫靜置15 min 后吸取2 mL 充分液化痰液，加入Cartridge 反應盒儀器檢測，2 h 后可讀取MTB鑒定和利福平耐藥性結果。Xpert MTB/RIF 技術檢測結核桿菌結果以高、中、低、極低和未檢出5 個量級來表示；利福平耐藥性檢測結果為檢出或未檢出表示。（4）液體培養法及結核菌鑒定和藥敏試驗：取1 mL 痰液經N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉消化處理，強力旋渦振蕩后室溫靜置，加入磷酸鹽緩沖液離心15 min 棄上清液制備成懸濁液，取0.5 mL 接種于培養管，采用BACTEC MGIT320 系統進行培養，培養陽性結果涂片抗酸染色鏡檢確認，同時采用MTB 抗原檢測試劑盒鑒定菌種。采用比例法對培養陽性MTB 菌株進行抗結核藥物檢測［4］。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0 統計軟件。計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。以臨床確診141 例肺結核患者為金標準，計算涂片熒光染色法、Xpert MTB/RIF 及液體培養法敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確率。Xpert MTB/RIF 法與比例法檢測RIF 耐藥一致性采用Kappa 檢驗，Kappa 值≥0.75 為研究方法與參照標準高度一致，0.40 ≤Kappa值＜0.75 為基本一致，Kappa 值＜0.40 為不一致。

2 結果

2.1 肺結核確診患者臨床特點 593 例初診疑似結核患者中141 例確診為肺結核患者，年齡14～92（58.41±21.09）歲，61～80 歲年齡段占37.6%。男性（75.2%）高于女性（24.8%），94.3%患者有肺部影像學改變，98.0%患者為繼發性肺結核病，見表1。

表1 141例確診肺結核患者臨床特點分析

2.2 三種方法檢測MTB 的效能和一致性比較 見表2-3。

表2 三種不同方法檢測MTB結果

表3 三種方法以臨床確診肺結核患者為金標準的檢測效能分析

2.3 三種方法鑒定MTB 結果不一致原因分析 三種方法檢測結果不一致其中154 例液體培養分離出分枝桿菌，140 株細菌結果鑒定為結核分枝桿菌復合群（MTBC），14 例檢出非結核分枝桿菌（NTM），14 例NTM對應Xpert MTB/RIF 法檢測為陰性，涂片熒光染色均為陽性。1 例熒光染色及Xpert MTB/RIF 陽性而培養陰性考慮菌量少而未培養出菌落，2 例僅熒光涂片陽性且菌量少可能為污染或為其它種類細菌，56 例涂片陰性肺結核Xpert MTB/RIF 與培養法均檢出MTB。

2.4 Xpert MTB/RIF 法檢測與比例法藥敏結果比較 140 株液體培養陽性MTB 菌株進行比例法藥敏試驗利福平耐藥率為5.7%，Xpert MTB/RIF 法檢測利福平耐藥率為5.0%。Xpert MTB/RIF 法檢測利福平耐藥率敏感性87.5%、特異性100%、準確性99.3%，與比例法藥敏性試驗結果一致性高Kappa 值為0.93。140 例結核分枝桿菌液體培養陽性患者MTB 利福平耐藥率女性與男性比較差異無統計學意義（χ2=0.71，P＞0.05）。見表4-5。

表4 140例結核分枝桿菌液體培養陽性患者Xpert MTB/RIF與比例法藥敏結果比較

表5 結核分枝桿菌培養陽性患者利福平藥敏結果與性別相關性［n（%）］

3 討論

目前檢測肺結核方法，包括痰液涂片、痰液培養以及分子生物學檢測。傳統涂片法檢測結核菌主要是抗酸染色或熒光染色顯微鏡下尋找病原體，但涂片法存在一定局限性如對標本的含菌量要求高、標本取材影響、是否開放性肺結核、涂片靈敏度、非結核分枝桿菌干擾等，導致其診斷肺結核病的敏感度較低，同時涂片操作也存在一定生物安全危險。傳統結核菌藥敏試驗基于病原菌培養基礎上的檢測，結核分支桿菌生長分裂一代約15～20 h，以結核分枝桿菌生長為基礎的培養方法和比例法體外藥敏試驗雖然結果可靠，但需要4～6 周，因此無論是痰液涂片鏡檢還是結核菌培養及藥敏均存在延誤結核病診斷。目前分子生物學檢測方法有其快速靈敏的優點，同時檢測方法日趨成熟，有效彌補傳統結核分枝桿菌培養等檢測方法的缺陷［5］。《WS288-2017 肺結核診斷》標準已將分子生物學檢查陽性作為肺結核病原學診斷依據之一，其中Xpert MTB/RIF 作為一種基于實時熒光定量核酸擴增檢測技術可同時實現MTB 和利福平耐藥性檢測已經被WHO 推薦使用［6］。

本研究對疑似肺結核患者痰液樣本同時采用涂片熒光染色法、Xpert MTB/RIF 法和液體培養法檢測，陽性率分別為16.7%、23.4%和23.6%，與張青等［7］研究結果一致。141 例臨床確診肺結核患者中男性高于女性，98%患者繼發性肺結核病。以臨床確診肺結核為金標準，Xpert MTB/RIF 法與液體培養法檢測結核菌結果有較高的一致性kappa 值均>0.9。但Xpert MTB/RIF 法檢測MTB 準確度（99.7%）高于熒光染色法（87.5%），差異有統計學意義（P＜0.05）與徐東芳等［8］研究結果一致。菌株鑒定結果表明，涂片熒光染色陽性標本中有14 例液體培養結果鑒定為NTM 但Xpert MTB/RIF 檢測為陰性，Xpert MTB/RIF 分子法較為準確的鑒定結核分枝桿菌，提高涂片染色陽性樣本中MTB 檢測的特異性。494 例涂片陰性患者痰液樣本中Xpert MTB/RIF 技術檢測MTB 的敏感性、特異性分別為96.6%和99.5%，與液體培養法比較差異無統計學意義（P＞0.05），對于涂片熒光染色陰性樣本Xpert MTB/RIF 技術有較高的敏感性和特異性，可以較好的補充痰涂片陰性患者肺結核檢出率，因此Xpert MTB/RIF 既可作替代涂片鏡檢的初始測試，也可作為涂片陰性肺結核的附加測試［9］。

結核菌常見耐藥為異煙肼和利福平，目前對MTB耐藥檢測常用傳統比例法藥敏試驗，然而該方法基于MTB 液體培養，再進行細菌藥敏試驗。由于MTB 生長較慢檢測周期長，從而影響患者及時治療，部分耐藥菌產生導致患者錯過最佳治療時機。文獻提示多數利福平耐藥結核菌株是由rpoB 基因核心區域上81bp 耐藥決定區突變所致，突變后細菌RNA 聚合酶的β-亞基結合位點不能與利福平藥物有效結合從而出現耐藥性［10］，同時多數結核菌對利福平耐藥株也表現為對異煙肼耐藥形成多重耐藥表型，因此rpoB 關鍵基因突變是多重耐藥結核菌分子檢測重要靶點，臨床中對利福平分子突變檢測進而推測藥物耐藥性可作為耐多藥結核菌的重要檢測指標［11］。同時Xpert MTB/RIF 分子檢測方法具有靈敏度高、檢測時間短、封閉檢測體系、操作安全等特點成為推薦檢測方法［12］，以比例法藥物敏感性試驗結果為金標準，比較Xpert MTB/RIF 方法檢測利福平藥敏結果，其敏感性為87.50%、特異性為100%，兩種方法比較差異無統計學意義（P＞0.05），檢測結果有較高的一致性，Kappa 值0.93。

綜上所述，Xpert MTB/RIF 技術操作簡單，敏感性和特異性較好，在肺結核中診斷價值較高，具有能同時快速鑒定MTB 和檢測RIF 耐藥性的特點，尤其是在耐多藥MTB 的篩選中具有重要價值，可為基層臨床快速選擇診療方案提供有效參考。