人牙齦間充質干細胞條件培養液促進大鼠皮膚創面愈合的實驗研究

張潔 楊華軍 趙偉 蔣巧平 李敏 胡勝杰

皮膚創傷破壞皮膚的生理功能并嚴重損害人們的生活質量，尋找促進皮膚創面愈合的方法一直是臨床工作的重要內容。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）在皮膚損傷修復方面成果豐富。牙齦間充質干細胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）是從牙齦中分離出的成體干細胞，已證實其在牙周組織再生領域中發揮重要作用［1］，但調控這一生物學過程的內在機制并不明確。近來研究顯示：MSCs 發揮作用的途徑是通過其旁分泌能力而非直接再生機制介導［2］。本研究通過建立大鼠皮膚切割傷模型，于創周4 點注射牙齦間充質干細胞條件培養液（human gingival mesenchymal stem cells derived conditioned medium，GMSCs-CM）并觀察其用于皮膚創面愈合的效果，旨在探討GMSCs-CM在皮膚創面愈合中的作用機制，為臨床皮膚創傷愈合尋找新的治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗動物：20 只8～10 周齡SD 大鼠，體質量約250 g，SPF 級，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。飼養環境：室溫23 ℃，采光良好，通風，給予專用飼料和水，專用籠喂養。實驗遵循國家制定的實驗動物使用和保護指南。動物實驗倫理審查表編號：（2020）年倫審（臨研）第（08）號。（2）實驗試劑：DMEM 培養基（Gibco，美國）；基礎培養基（賽百慷公司）；兔抗人CD31 抗體（北京中杉金橋生物公司，中國）；兔抗鼠pCNA 抗體（Gene Tex 公司，美國）；兔抗鼠VEGF 抗體（Immunoway 公司，美國）；兔抗鼠TGF-b1（華安生物，中國）；兔抗鼠β-Actin 抗體（Abclonal 公司，美國）；Invent Minute（TM）動物總蛋白提取試劑盒（英文特生物技術，美國）。（3）實驗儀器：4℃離心機ST16R（Thermo 公司，美國）；CAVOY（凱元）Mini P-4 小型垂直電泳儀（CAVOY，中國）；Clinx ChemiScope 熒光及化學發光成像系統（Clinx，中國）；Nano Drop 2000（Thermo Fisher，美國）。

1.2 實驗方法 （1）細胞來源和培養：GMSCs 購自賽百慷生物技術股份有限公司，使用基礎培養基傳代培養，實驗選用第3～4 代。人成纖維細胞為重慶醫科大學贈送，使用DMEM 培養基培養，實驗選用第5 代。（2）制備GMSCs-CM：將5×105GMSCs 接種在T25 的培養瓶培養，當細胞達80%融合時漂洗，加入無添加劑的基礎培養基5 mL。培養48 h 后收集細胞上清液于15 mL 離心管中，500 g 離心5 min，使用0.22 μm 孔徑濾過膜過濾，即得到GMSCs-CM。將收集到的GMSCs-CM 采用Millpore 超濾離心管濃縮（5,000 g，40 min，4℃），nanodrop 測定蛋白質濃度，備用。（3）大鼠皮膚切割傷模型制備：20 只大鼠經異氟烷吸入麻醉后，俯臥于手術臺，備皮，消毒。取脊柱中下部的兩側對稱皮膚，選擇2 cm 直徑圓孔定位，脊柱左側一個孔，右側兩個孔，三孔保持>0.8 mm 間距以避免肌肉收縮影響愈合判定，因每只鼠三個孔注射同一種藥物故不考慮藥物間相互滲透干擾。使用眼科剪沿定位線邊緣剪開皮膚，鈍性分離筋膜層以減少皮下毛細血管出血，后沿定位線剪下全部皮膚，將每只鼠三個孔全部剪除完畢止血后，放置于布有加溫墊的鼠盒中等待蘇醒。（4）實驗動物分組和處理：20 只大鼠建立皮膚切割傷模型，隨機分為GMSCs-CM 組和PBS 組，每組各10 只。GMSCs-CM 組在模型建立后立即于創周4 點注射GMSCs-CM 200 μL（15 μg/mL），PBS 組在模型建立后立即于創周4 點注射PBS 液200 μL（15 μg/mL），1 次/d，連續3 d。模型制備并注射的當天記為第1 天。（5）創面愈合情況和愈合率測定：分別在第1、3、7、14 天用游標卡尺測量大鼠創面的大?。ǖ? 天為注射后立即測量，視為初始創面面積），每只鼠測量三個數據求取平均值，觀察皮膚創面愈合情況并計算創面愈合率，創面愈合率=（初始創面面積-第N 天創面面積）/初始創面面積×100%。（6）創面組織病理形態觀察：造模第14 天處死大鼠，取創周5 mm 皮膚標本，制成組織蠟塊并切片，行HE 染色處理后顯微鏡下觀察。（7）免疫組化分析：同（6）標本處理方法制成組織切片，免疫組織化學染色檢測CD31（1 ∶200）的表達。采用EnVison 兩步法進行。參考Weidner［3］提出的計數方法，應用CD31 標記毛細血管內皮細胞的細胞質和細胞膜，以單個棕黃色內皮細胞或內皮細胞團作為1 個毛細血管，在低倍鏡（40 倍）下選出3 個血管密集區域，轉100 倍鏡下隨機選3 個視野，計數毛細血管數量，取平均值為MVD值。（8）Western blot 方法檢測各時間點大鼠皮膚創面組織中增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-b1）和血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白的表達：從造模第3、7、14 天的創周5 mm 皮膚組織中提取細胞總蛋白，進行蛋白質印跡以檢測目標蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，在10%變性SDS-PAGE 凝膠上運行40 μg 總蛋白，濃縮膠60 V 電泳1 h，分離膠100 V 電泳2 h，常規濕法轉膜90 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，免疫抗體反應（稀釋比例：一抗：PCNA 1 ∶1,000，VEGF 1 ∶1,000，TGF-b1 1 ∶1,000。β-actin 1 ∶3,000；二抗：山羊抗兔1 ∶5,000）。ECL 化學發光系統檢測，凝膠成像系統顯影。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism 8 進行統計學分析與繪制圖像。計量資料以（±s）表示，當方差齊時，采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）進行多組間比較，并采用Bonferroni 進行檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠創面愈合率 與PBS 組相比，GMSCs-CM 組在第3、7、14 天的創面面積均有不同程度的縮??；第14 天，GMSCs-CM 組的創面接近完全愈合（見圖1A）。分別計算兩組第3、7、14 天的創面愈合率，結果顯示（見圖1B）：第7、14 天時GMSCs-CM 組的創面愈合率明顯高于PBS 組（P＜0.05）。

圖1 大鼠創面愈合情況和愈合率。A. PBS組和GMSCs-CM組同一只大鼠不同時間段的創面愈合情況；B.各組治療第 3、7、14天的創面愈合率。**P＜0.01

2.2 大鼠創面皮膚組織學觀察 （1）HE 染色：取GMSCs-CM 組和PBS 組第14 天的創面組織進行HE 染色，比較兩組組織學差異。結果顯示：PBS 組顯示為不良的成纖維細胞及血管，有少量炎細胞浸潤。GMSCs-CM 組大鼠皮膚創面中成纖維細胞、膠原纖維和血管增加，炎癥細胞浸潤明顯（見圖2）。（2）免疫組化：取GMSCs-CM 組和PBS 組第14 天的創面組織進行免疫組織學分析。CD31 染色陽性的細胞呈棕黃色，排列可見明顯的血管管狀結構（見圖3）；PBS 組中MVD 為（14.67±1.53），GMSCs-CM 組中MVD 為（30.33±4.16），GMSCs-CM 組中MVD 顯著高于PBS 組（P＜0.01）。

圖2 治療第14天大鼠創面組織HE染色（×200）。A.PBS組，不良的成纖維細胞（F）和血管（B），少量炎細胞浸潤；B. GMSCs-CM組，可見成纖維細胞、膠原纖維（C）和血管增加，炎癥細胞浸潤明顯

圖3 治療第14天大鼠創面組織CD31免疫組化染色（×100）。CD31表達陽性主要存在于新生的毛細血管內皮細胞中，染色呈棕黃色（箭頭所示）。A.PBS組，新生的毛細血管數量較少；B.GMSCs-CM組，新生的毛細血管數量較多且密集

2.3 GMSCs-CM 對大鼠皮膚創面組織中PCNA、VEGF、TGF-b1的表達影響 取GMSCs-CM組和PBS組治療第3、7、14 天的創面組織，檢測PCNA、VEGF、TGF-b1的蛋白表達，結果顯示（見圖4）：與PBS 組相比，GMSCs-CM 組PCNA、VEGF、TGF-b1 表達均上調且差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 Western blot檢測抗體顯影結果及灰度值分析圖。A.Western blot檢測抗體顯影結果（1、3、5：PBS組；2、4、6：GMSCs-CM組）；B.Western blot檢測灰度值分析

3 討論

創面愈合對維持皮膚的完整性和功能性起到至關重要的作用，MSCs 是目前創面愈合治療中最有價值的醫療手段［4］。近年來研究表明：MSCs 發揮生物學效應的主要方式是通過旁分泌作用而非直接分化機制。GMSCs作為口腔來源的MSCs 更易以微創的方式獲得，已有研究證明GMSCs 在角膜、牙周、神經組織修復中起治療作用［5］。本實驗研究中通過建立大鼠皮膚創面切割傷模型，將培養的GMSCs-CM 局部注射入大鼠皮膚創面，通過對比觀察顯示：GMSCs-CM 組不僅創面愈合速度更快，且創面愈合率增高，治療第7、14 天時創面愈合率與PBS 組相比均有顯著差異。

成纖維細胞在皮膚創面愈合過程中的調節作用占主導地位［6］。本實驗通過病理學檢查發現：GMSCs-CM組創面組織的成纖維細胞數量和膠原纖維的數量明顯增多。PCNA 是DNA 復制和修復的重要因素，作為評價細胞增殖狀態的重要指標，已證實在皮膚組織的發生和修復過程中表達增強［7］。實驗蛋白質印跡分析結果顯示：各個時間段GMSCs-CM 組PCNA 的表達水平均高于PBS 組，治療7 d 時PCNA 的表達水平最高，而隨著愈合時間的推進，PCNA 的水平又逐漸降低。結果提示：注射GMSCs-CM 可促進成纖維細胞增殖，而隨著愈合過程的進展又不至于過度增殖導致皮膚組織纖維化而形成瘢痕。

血管生成被認為是創面愈合所必需的［8］。新生的血管參與肉芽組織的形成，并為生長中的組織提供營養和氧氣，其對于細胞的增殖和為炎癥細胞創造通路至關重要。CD31 是血管內皮細胞的標志物，用于評估傷口愈合過程中的新生毛細血管［9］。作者通過采用CD31 進行免疫染色來確定傷口修復區域的新生毛細血管密度，結果顯示：與PBS 組相比，GMSCs-CM 組CD31 表達陽性細胞數量增加，表明GMSCs-CM 在體內促進新生血管的形成。同時實驗顯示，隨著毛細血管新生同時出現的還有大量的炎癥細胞，分析這主要與炎癥細胞產生大量的原血管生成介質有關。

創面愈過程受各種因子的調節。生長因子VEGF 是刺激血管生成的重要因素，其與其他血管生成因子協同作用以刺激和維持血管系統。同時有研究證實，VEGF的表達水平顯示出與血管密度相似的增加趨勢［10］。VEGF 轉錄的分泌在急性病變中升高，在創面愈合早期，VEGF 作用于血管生成和肉芽組織形成［11］。TGF-b1全程參與并調節創面愈合的三個階段［12］：愈合早期調節免疫細胞功能助于炎癥消退；組織形成期促進再上皮化進程；基質重塑階段調控細胞外基質的平衡狀態。本實驗蛋白質印跡分析結果顯示：GMSCs-CM 處理的創面中VEGF 和TGF-b1 的蛋白含量較PBS 組均升高，14 d 時PBS 組VEGF 的表達下降明顯，而GMSCs-CM組VEGF 表達雖有下降但仍維持在較高的水平。14 d時TGF-b1 的表達較PBS 組升高顯著。因此，作者認為GMSCs-CM 通過增加血管生成因子的釋放而影響血管和肉芽組織的形成，從而加速創面愈合的速度。

綜上所述，注射GMSCs-CM 可加快皮膚創面成纖維細胞的增殖并減少過度的瘢痕增生，同時增加創面毛細血管和肉芽組織的形成，從而加快再上皮化進程促進創面的愈合，其潛在的機制可能是通過上調VEGF 和TGF-b1 的表達來實現。因此，GMSCs-CM 可成為臨床上促進皮膚創面愈合的一種新的治療策略。