丹參多酚酸鹽抑制氧化應激減輕阿霉素誘導的心臟毒性研究

張旼旼，黃新宇，戴慧

丹參多酚酸鹽抑制氧化應激減輕阿霉素誘導的心臟毒性研究

張旼旼1，黃新宇2，戴慧1

1.浙江大學醫學院附屬杭州市腫瘤醫院放療科，浙江杭州 310002；2.浙江大學醫學院附屬杭州市腫瘤醫院腫瘤內科，浙江杭州 310002

探究丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）對阿霉素（adriamycin，ADM）誘導心臟毒性的保護作用及調控機制。采用隨機數字表法將40只小鼠分為對照組、ADM組、等效劑量丹參多酚酸鹽（equivalent dose of salvianolate，ESAL）組和高劑量丹參多酚酸鹽（high-dose salvianolate，HSAL）組，每組10只，超聲檢測心臟結構和功能，測量小鼠體質量和心臟重量計算心臟體質量比，蘇木精–伊紅染色觀察心臟組織形態，TUNEL檢測法檢測心臟組織凋亡，ELISA法檢測小鼠血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量水平。將小鼠心肌細胞仍分為上述四組，每組均設3個重復孔，每個實驗重復3次。CCK-8和流式細胞術檢測心肌細胞活性和凋亡；ELISA法檢測心肌細胞上清液中LDH、AST、MDA和SOD的含量。SAL可減輕ADM誘導的心肌肥厚、改善射血分數和降低心臟體質量比（<0.05），減輕心肌組織纖維化，減少組織細胞發生凋亡（<0.05）；降低了ADM誘導的小鼠血清中LDH、AST、BNP和MDA水平（<0.05），升高了SOD的水平（<0.05）；SAL能提高ADM抑制的心肌細胞活性（<0.05）、減少細胞凋亡（<0.05），降低了小鼠心肌細胞中LDH、AST和MDA水平（<0.05），升高了SOD的水平（<0.05）。SAL可能通過抑制氧化應激發揮對ADM誘導的心臟毒性的保護作用。

丹參多酚酸鹽；阿霉素；心臟毒性

蒽環類抗腫瘤藥物阿霉素（adriamycin，ADM），是臨床廣泛使用的細胞毒性藥物之一。研究顯示，如果使用劑量超出400～700mg/m2的范圍，蒽環類藥物會導致劑量依賴性的心臟毒性[1]，因而ADM在臨床使用中受到劑量限制[2]。右丙亞胺（dexrazoxane，DEX）是美國食品藥品監督管理局批準臨床使用的心臟保護劑，但其具有生殖毒性，且可加重化療藥物引起的骨髓抑制，長期使用可發生繼發性惡性腫瘤（主要為急性髓性白血病）[3]。丹參的水溶性成分丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）具有減輕氧自由基損傷、提高機體抗脂質過氧化的作用，SAL能使缺血再灌注后的心肌凋亡細胞數明顯減少[4]。本研究通過動物和細胞實驗來研究SAL對ADM誘導的心臟毒性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

選取6周齡雄性C3H/HeN小鼠40只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2016-0011]。適應性飼養1周后開始實驗。小鼠原代心肌細胞（批號：CPKP-M073）購自賽百慷（上海）生物技術有限公司。本研究經江大學醫學院附屬杭州市腫瘤醫院動物倫理委員會批準（倫理審批號：EYOUNG-20210205-03）。

1.2 藥物與試劑

阿霉素（生產單位：輝瑞制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20013334，規格：10mg/瓶）；蘇木精–伊紅染液套裝、蛋白酶K、TUNEL試劑盒和DAPI均購自武漢賽維爾生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，細胞凋亡試劑盒購自美國BD醫療器械有限公司，小鼠ELISA試劑盒購購自江蘇酶免實業有限公司。

1.3 藥物制備與分組

1.3.1 丹參多酚酸鹽制備 丹參的風干根購自杭州市中醫院中藥房，通過蒸餾水將丹參干燥的根部煮沸制備，采用高效液相色譜法對丹參多酚酸鹽進行含量測定，將提取物用生理鹽水稀釋成10mg/ml，4℃保存備用[5]。

1.3.2 動物分組與給藥 40只小鼠采用隨機數字表法分為對照組、ADM組、ESAL組、HSAL組，每組10只。對照組第5、12天于小鼠腹腔左側注射生理鹽水2ml，ADM組第5、12天于腹腔左側注射ADM 7.5mg/kg，注射體積2ml，給藥方式和劑量參考先前報道[6]；對照組和ADM組小鼠腹腔右側均每天注射生理鹽水2ml。ESAL組和HSAL組除第5、12天于腹腔左側注射7.5mg/kg ADM 2ml外，每天于腹腔右側注射SAL（ESAL為15mg/kg，HSAL為30mg/kg）2ml，連續14天。

1.3.3 細胞分組與給藥 細胞實驗仍設置對照組、ADM組、ESAL組、HSAL組，每組均設3個重復孔，每個實驗重復3次。對照組不加藥物，ADM組加入ADM 20μmol/L，ESAL組和HSAL組除加入ADM 20μmol/L外，還需加入SAL（ESAL為14μmol/L，HSAL為28μmol/L），培養24h后進行后續實驗。

1.3.4 心臟結構和功能檢測 將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，備皮，采用動物超聲成像系統，取5個心動周期的平均值記錄數據，評價小鼠心臟結構與功能。心臟結構監測包括左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、室間隔舒張末室厚度（intraventricular septum end-diastolic thickness，IVSEDT）、室間隔收縮末厚度（intraventricular septum end-systolic thickness，IVSEST），左心室后壁舒張末厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVEDPWT）和左心室后壁收縮末厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVESPWT），這些指標均反映了心臟的肥厚程度；評價心臟功能指標包括左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening LVFS）。

1.4 心臟體質量比

處死小鼠，取出心臟，稱小鼠體質量和全心重量，計算心臟心臟體質量比[全心重量（g）/體質量（g）]。

1.5 蘇木精-伊紅染色

將石蠟包埋的心臟組織標本切片、脫蠟，蘇木精–伊紅染色，脫水封片后，顯微鏡下采集圖像并分析（細胞核呈藍色，細胞質呈紅色）。

1.6 組織凋亡染色

心臟組織切片脫蠟、蛋白酶K修復、破膜，按TUNEL試劑盒說明書步驟，進行組織凋亡染色；使用DAPI復染細胞核，封片后于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像（DAPI染出的細胞核在紫外的激發下呈藍色，FITC熒光素標記陽性凋亡細胞核呈綠色）；心肌組織凋亡率：分別計數400倍的高倍鏡下至少5個視野內的綠色細胞數與藍色細胞數的比率。

1.7 細胞活性檢測

取小鼠原代心肌細胞，將對數生長的心肌細胞以3×104細胞/孔的密度鋪于96孔板中，給藥處理24h，CCK-8試劑盒評估細胞活力，使用酶標儀在450nm的波長下測量吸光度（）值，計算細胞存活率，細胞活性＝（實驗組值–空白調零值）/（對照組值–空白調零值）×100%。

1.8 細胞凋亡檢測

取對數生長期心肌細胞以1.2×106細胞/孔種植于6孔板，給藥處理24h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9 小鼠血清和原代心肌細胞中LDH、MDA、SOD、AST、BNP含量變化

C3H/HeN小鼠取血或取小鼠原代心肌細胞，離心后取上清液，ELISA試劑盒分析小鼠血清或心肌細胞上清液中LDH、MDA、SOD、AST、BNP的含量變化。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠心臟結構和功能比較

與對照組比較，ADM組、ESAL組和HSAL組中小鼠心臟結構指標（LVEDD、LVESD、IVSEDT、IVSEST、LVEDPWT和LVESPWT）數值均顯著增加（<0.05），與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中小鼠心肌肥厚度顯著下降（<0.05）。與ADM組比較，ESAL組和HSAL組均可改善心臟射血功能（<0.05），見表1。ESAL組和HSAL組間心肌肥厚程度和心臟射血功能比較，差異均無統計學意義（>0.05），見表1。與對照組比較，各給藥組中小鼠LVEF、LVFS顯著降低（<0.05），見圖1。

表1 各組小鼠心臟結構和功能比較（，mm，n=5）

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖1 各組小鼠LVEF和LVFS比較

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

2.2 小鼠心臟體質量比比較

與對照組比較，各給藥組中小鼠心臟體質量比均顯著性升高（<0.05），與ADM組比較，ESAL組和HSAL組均可減輕ADM誘導的心臟水腫（<0.05），但ESAL組和HSAL組比較，差異無統計學意義（>0.05），見表2。

表2 各組小鼠全心重量、體質量及心臟體質量比變化情況（，n=5）

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

2.3 各組小鼠心肌組織形態變化

對照組小鼠心肌細胞核位于細胞中部，呈長橢圓形，心肌纖維排列整齊，間隙大小均等；而ADM組中心肌細胞損傷較嚴重，細胞腫脹變圓，心肌細胞纖維化明顯，排列紊亂，間隙大小不一；與ADM組相比，ESAL組和HSAL組心肌細胞損傷均有不同程度的恢復，其中HSAL組心肌細胞腫脹程度明顯減輕，心肌纖維排列部分恢復有序狀態，見圖2。

2.4 各組小鼠心肌組織凋亡情況比較

與對照組相比，各給藥組組中TUNEL染色陽性（綠色熒光，圖3A）的細胞增多，心肌組織凋亡率顯著升高（圖3B）（<0.05）；與ADM組比較，ESAL和HSAL組均可顯著減少ADM誘導的心肌組織凋亡（<0.05），ESAL和HSAL組比較，差異無統計學意義（>0.05），見圖3。

2.5 各組小鼠血清中LDH、AST、BNP、MDA和SOD水平比較

與對照組比較，各給藥組小鼠血清中LDH、AST、BNP和MDA的含量均顯著升高（<0.05），SOD的含量均顯著降低（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組均顯著降低ADM誘導的LDH、AST、BNP和MDA的水平（<0.05），顯著升高SOD水平（<0.05），ESAL組和HSAL組比較，差異無統計學意義（>0.05），見圖4。

2.6 各組小數心肌細胞活性比較

與對照組比較，各給藥組小鼠原代心肌細胞的存活率顯著降低（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中心肌細胞的細胞活性顯著升高（<0.05），ESAL組和HSAL組比較，差異無統計學意義（>0.05），見圖5。

2.7 各組小鼠心肌細胞凋亡情況比較

與對照組比較，各給藥組心肌細胞的細胞凋亡率顯著升高（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中細胞凋亡率均顯著降低（<0.05），ESAL組和HSAL組比較，差異無統計學意義（>0.05），見圖6。

2.8 各組小鼠LDH、AST、MDA和SOD的含量比較

與對照組比較，各給藥組心肌細胞上清液中LDH、AST和MDA的含量均顯著升高（<0.05），SOD的含量均顯著降低（<0.05）；與ADM組比較，ESAL組和HSAL組中LDH、AST和MDA含量均降低（<0.05），SOD含量顯著升高（<0.05），ESAL組和HSAL組間上述指標比較，差異無統計學意義（>0.05），見圖7。

圖2 小鼠心肌組織形態變化（HE染色，×200）

圖3 各組小鼠心肌組織凋亡情況比較

A.TUNEL染色觀察心肌組織凋亡（×400）；B.各組小鼠心肌組織凋亡率

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖4 各組小鼠血清中LDH、AST、BNP、MDA和SOD的水平比較

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖5 CCK-8檢測心肌細胞存活率

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖6 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

圖7 各組小鼠LDH、AST、MDA和SOD水平比較

注：與對照組比較，*<0.05；與ADM組比較，#<0.05

3 討論

ADM誘導的心臟毒性在腫瘤治療中是極其嚴重的不良反應，現有多種機制來解釋ADM引起的心臟毒性的發病機制，包括氧化應激、脂質過氧化等[7-8]。阿霉素誘導心肌毒性的產生已被證實與氧自由基相關，尤其是抗氧化物SOD減少、活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多，從而觸發氧化應激事件導致細胞損傷[7]。ADM可以導致細胞內外多種生化成份過氧化堆積，如脂質過氧化物MDA，MDA可損傷生物膜，使膜酶受損、活性降低，進而導致心肌細胞變性壞死[8]。此外，ADM誘導的心肌損害，會導致心臟毒性生物標志物，如LDH、AST、BNP等從受損的心肌細胞中釋放，這些都可作為監測ADM 誘導心臟毒性的敏感指標[9]。盡管已經進行了廣泛的研究以減少ADM誘導的心臟毒性，但尚未發現安全有效的預防措施。

丹參多酚酸鹽是由中藥材丹參的根提制而成，它具有鎮靜、抗氧化和促進血液循環等作用。丹參中主要包含脂溶性和水溶性化合物兩大成分，其中，水溶性化合物主要由丹參素、原兒茶酚及SAL等組成。有研究報道，SAL具有抗氧化和清除自由基作用，可以保護細胞免受氧化應激[10]。Hung等[11]研究發現丹參水提取物對ADM介導的大鼠心肌來源的H9c2細胞的死亡具有劑量依賴性的保護作用。

本研究結果顯示，SAL可減輕ADM預處理后小鼠心肌肥厚、改善心臟射血功能和減輕心臟水腫、減少心肌纖維化和心肌組織凋亡的發生，還可以減少小鼠心臟毒性指標（LDH、AST和BNP）釋放。在細胞實驗中，SAL增強了心肌細胞活性和抑制心肌細胞凋亡，同樣可以降低心肌細胞上清液中LDH、AST水平。通過上述體外體內實驗，證實SAL對ADM誘導的心臟毒性具有保護作用。本研究中還通過ELISA法檢測了小鼠血清和原代心肌細胞上清液中SOD和MDA水平，結果證實SAL可以促進SOD的釋放及抑制MDA的表達。

綜上所述，SAL可能是通過促進抗氧化物SOD釋放以減少氧化應激事件、抑制脂質過氧化物MDA產生以減輕ADM對細胞膜的損傷，進而抑制心肌細胞和心肌組織發生凋亡，從而發揮其對ADM誘導心臟毒性的保護作用的。這一結果有可能為臨床安全使用ADM提供更加有效的措施。但SAL具體如何促進抗氧化劑SOD釋放及抑制脂質過氧化MDA產生的機制仍不清楚，需要更進一步的研究來揭示相關的分子機制。

[1] NEBIGIL C G, DéSAUBRY L.Updates in anthracycline- mediated cardiotoxicity[J]. Front Pharmacol, 2018, 12(9): 1262.

[2] CARVALHO C, SANTOS R X, CARDOSO S, et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly e?ect[J]. Curr Med Chem, 2009, 16(25): 3267–3285.

[3] REICHARDT P, TABONE M D, MORA J, et al. Risk-bene?t of dexrazoxane for preventing anthracycline- related cardiotoxicity: re-evaluating the European labeling[J]. Future Oncol, 2018, 14(25): 2663–2676.

[4] 趙全如,謝曉燕. 丹參的化學成分及藥理作用研究進展[J]. 廣東化工,2021, 48(1): 57–59.

[5] LIU K, ZHANG J W, LIU X G, et al. Correlation between macroscopic characteristics and tissue-speci?c chemical pro?ling of the root of Salvia miltiorrhiza[J]. Phytomedicine, 2018, 1(51): 104–111.

[6] YOU J S, PAN T L, LEE Y S. Protective effects of Danshen (Salvia miltiorrhiza) on adriamycin-induced cardiac and hepatic toxicity in rats[J]. Phytother Res, 2007, 21(12): 1146–1152.

[7] OCTAVIA Y, TOCCHETTI C G, GABRIELSON K L, et al.Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies[J]. J Mol Cell Cardiol, 2012, 52(6): 1213–1225.

[8] MENG Y Y, YUAN Y P, ZHANG X, et al. Protection against doxorubicin-induced cytotoxicity by geniposide involves AMPKα signaling pathway[J]. Oxid Med Cell Longev, 2019, 26: 7901735.

[9] YU W, QIN X, ZHANG Y, et al. Curcumin suppresses doxorubicin-induced cardiomyocyte pyroptosis via a PI3K/Akt/mTOR-dependent manner[J]. Cardiovasc Diagn Ther, 2020, 10(4): 752–769.

[10] HSU Y C, LIN Y L, CHIU Y T, et al. Antifibrotic effects of Salvia miltiorrhiza on dimethylnitrosamine- intoxicated rats[J]. J Biomed Sci, 2005, 12(1): 185–195.

[11] HUNG Y C, WANG P W, LIN T, et al. Functional redox proteomics reveal that salvia miltiorrhiza aqueous extract alleviates adriamycin-induced cardiomyopathy via inhibiting ros-dependent apoptosis[J]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020: 5136934.

Study on the inhibition of oxidative stress by salvia polyphenolates to alleviate adriamycin-induced cardiotoxicity

ZHANG Minmin, HUANG Xinyu, DAI Hui

1.Department of Radiotherapy, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310002, Zhejiang, China; 2.Department of Medical Oncology, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310002, Zhejiang, China

To investigate the protective effect and regulatory mechanism of salvianolate (SAL) on adriamycin (ADM)-induced cardiotoxicity.A total of 40 mice were randomly divided into control group, ADM group, equivalent dose of salvianolate (ESAL) group, high-dose salvianolate group (HSAL) group, with 10 rats in each group. The heart structure and cardiac function were detected by ultrasound, the weight and heart weight of mice were measured to calculate the heart weight ratio, and the morphology of heart tissue was observed by HE staining, TUNEL assay to detect cardiac tissue apoptosis, ELISA method was used to detect the contents of lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (AST), B-type natriuretic peptide (BNP), malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in mouse serum. The mouse primary cardiomyocytes were still divided into the above 4 groups, with each group consisting of three repeated wells, and each experiment was repeated three times. the cardiomyocyte activity and apoptosis were detected by CCK-8 and apoptosis kit; ELISA method was used to detect LDH, AST, MDA and SOD content in cardiomyocyte culture medium.SAL can reduce ADM induced myocardial hypertrophy, improve ejection fraction and reduce heart weight ratio (<0.05), reduce myocardial fibrosis, and reduce apoptosis of tissue cells (<0.05). It decreased the levels of LDH, AST, BNP and MDA in serum of mice induced by ADM (<0.05), and increased the level of SOD (<0.05). SAL can increase the activity of cardiomyocytes inhibited by ADM (<0.05), reduce apoptosis (<0.05), decreased the level of LDH, AST and MDA in mouse cardiomyocytes (<0.05), increased the level of SOD (<0.05).SAL may play a protective role on ADM induced cardiotoxicity by inhibiting oxidative stress.

Salvianolate; Adriamycin; Cardiotoxicity

R273

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.024

杭州市農業與社會發展科研項目（20180533B64）

黃新宇，電子信箱：zhouhui3k686@163.com

（2022–11–13）

（2023–08–20）