腎穿刺樣本冷凍切片的質(zhì)量改進方法研究

朱國良，張曉嵐，崔戈

腎穿刺樣本冷凍切片的質(zhì)量改進方法研究

朱國良，張曉嵐，崔戈

湖州市第一人民醫(yī)院病理科，浙江湖州 313000

提高腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率。選取2021年9月至12月湖州市第一人民醫(yī)院28例臨床患者腎穿刺組織，通過改進腎穿刺樣本冷凍取材、包埋及切片等系列方法，提高腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率。改進法腎小球切出率（100%）顯著高于傳統(tǒng)法腎小球切出率（82.14%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2=5.490，=0.026）；改進法冷凍切片優(yōu)良率（96.43%）顯著高于傳統(tǒng)法冷凍切片優(yōu)良率（71.43%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2=8.347，=0.004）。通過改進方法，提高了腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率，有臨床推廣的應(yīng)用價值。

腎穿刺樣本；冷凍切片；改進方法

腎穿刺樣本獲取困難、彌足珍貴，其結(jié)構(gòu)的完整性直接影響其病理診斷。傳統(tǒng)腎穿刺冷凍切片技術(shù)難以保證每次截取的組織能夠切出腎小球，有時需要多次重取組織。此外，包埋方式、溫度和時間的控制對于保證切片質(zhì)量非常關(guān)鍵[1-5]。本研究通過對組織預(yù)處理及對樣本頭預(yù)準(zhǔn)備等一系列工作環(huán)節(jié)進行改進，較大程度地保證了腎穿刺樣本冷凍切片的質(zhì)量，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取湖州市第一人民醫(yī)院2021年9月至12月的28例臨床患者腎穿刺組織，穿刺空心針型號為16G，外徑3mm，每例患者包含2～3條長度為1.0～2.0cm的穿刺組織，選兩條組織，各取長約0.5cm用于免疫熒光檢查的冷凍制片，分為改進組和傳統(tǒng)組，兩組樣本分別應(yīng)用改進方法與傳統(tǒng)方法進行冷凍制片。本研究通過湖州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研與臨床試驗倫理委員會審查（倫理審批號：2022121401）。

1.2 方法

1.2.1 組織截取 傳統(tǒng)組：選擇其中的一條腎穿刺組織，用切片刀由組織的一端切取0.2cm做電鏡，再切取0.5cm左右做冷凍切片，其余組織做常規(guī)病理。改進組：腎組織皮質(zhì)端顏色稍蒼白，髓質(zhì)端顏色稍紅。分割組織時先借助手機攝像頭的放大功能區(qū)分皮質(zhì)端和髓質(zhì)端，再用切片刀將組織由皮質(zhì)端切取0.2cm做電鏡，然后切取0.5cm左右做冷凍制片，其余組織做常規(guī)病理[6]。

1.2.2 樣本頭準(zhǔn)備 傳統(tǒng)組：冷凍切片機箱體溫度設(shè)定為–21℃，將膠水滴加于樣本托上，待膠水半凝固后放樣本。改進組：冷凍切片機（徠卡1950）箱體溫度設(shè)定為–17℃。在樣本托上滴加適量膠水，使其成橢圓形后置于冷凍切片機速凍臺上，待其冷卻凝固，將樣本頭移至切片機機頭上，使膠水的長軸與刀口垂直，然后對膠水進行第1次粗修，使膠水成為平整的平臺。

1.2.3 腎穿刺組織包埋 傳統(tǒng)組：將1段長0.5cm的腎穿刺組織包埋于半凝固狀態(tài)的膠水中，盡量平放，隨即迅速轉(zhuǎn)移至速凍臺使其凝固（圖1A）。改進組：取下樣本托迅速將0.5cm的組織平放在已粗修平整的膠水平臺表面，使組織的長軸與膠水平臺的長軸垂直，再用膠水完整覆蓋組織，并沿膠水平臺的長軸方向在組織上下兩邊適當(dāng)添加膠水，隨即迅速轉(zhuǎn)移至速凍臺使其凝固（圖1B）。

1.2.4 冷凍切片操作 傳統(tǒng)組：膠水凝固后將樣本托固定于機頭上，調(diào)節(jié)刀片與樣本托的距離，緩慢粗修，觀察穿刺組織的暴露情況。細修出組織后試染1張，顯微鏡下觀察腎小球的情況。按本研究要求完成所需切片數(shù)，最后1張進行冷凍HE染色，對比起始切片中腎小球的數(shù)量及分布情況，確定熒光染色片的選擇順序。改進組：將樣本托移至機頭，保持與粗修時角度一致，鎖緊并調(diào)節(jié)刀片與樣本托的前后距離，到位后二次粗修。觀察兩次膠水間的落差控制粗修進度，修出組織完整切面后試染一張于顯微鏡下觀察腎小球。按照本科室免疫熒光檢測要求，連續(xù)切片，最后1張進行冷凍HE染色以對比切片質(zhì)量，分析起始切片中腎小球數(shù)量及分布情況，確定熒光染色片的選擇順序。

1.2.5 顯微鏡下觀察切片質(zhì)量 兩組切片同時進行HE染色后顯微鏡下觀察，并記錄切片質(zhì)量。評價方法參照《簡明病理學(xué)技術(shù)》[7]：切片完整、薄、厚薄均勻；細胞無收縮退變；組織無卷曲、折疊；組織有無碎裂、褶皺。以截取一次組織能成功切出腎小球的例數(shù)占總例數(shù)的比率作為腎小球切出率。以細胞無收縮，組織無卷曲、折疊、碎裂的切片數(shù)占總片數(shù)的比率作為切片優(yōu)良率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[（%）]表示，組間比較采用2檢驗，<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

切片質(zhì)量：傳統(tǒng)法組織碎裂、卷曲、與包埋劑分離，有膠水空洞；改進法組織平整、與包埋劑完全融合，無膠水空洞，見圖2。

染色后鏡下觀察：傳統(tǒng)法組織碎裂、結(jié)構(gòu)不完整、折疊，染色尚清晰；改進法組織結(jié)構(gòu)完整、無折疊，染色清晰，見圖3。

改進法腎小球切出率為100%，傳統(tǒng)法腎小球切出率為82.14%；改進法切片優(yōu)良率為96.43%，傳統(tǒng)法切片優(yōu)良率為71.43%。改進法的腎小球切出率顯著高于傳統(tǒng)法腎小球切出率（2=5.490，=0.026）；改進法的切片優(yōu)良率顯著高于傳統(tǒng)法切片優(yōu)良率（2=8.347，=0.004）。

3 討論

腎穿刺樣本冷凍切片的質(zhì)量直接關(guān)系到免疫熒光染色結(jié)果的優(yōu)劣。腎穿刺樣本一般直徑較小，條數(shù)較少，但需要的冷凍切片數(shù)量卻很多（15～18片），制作出高質(zhì)量的冷凍切片具有較大難度。穿刺樣本冷凍制片過程中經(jīng)常出現(xiàn)以下問題：切片上腎小球不足或無腎小球；切片上組織斷續(xù)不成條、不完整；切片上組織出現(xiàn)空洞；切片上組織卷曲、折疊；組織發(fā)脆，切片呈碎裂狀及無法完整制片等。產(chǎn)生上述問題的原因與穿刺樣本運送流程、組織冷凍溫度、冷凍持續(xù)時間及制片技巧等有關(guān)[8-14]。

圖1 傳統(tǒng)法與改進法腎穿刺組織的包埋方式

A.傳統(tǒng)組；B.改進組

圖2 傳統(tǒng)法與改進法腎穿刺組織的切片質(zhì)量

A.傳統(tǒng)組；B.改進組

圖3 傳統(tǒng)法與改進法腎穿刺組織的染色質(zhì)量（HE染色，×20）

A.傳統(tǒng)組；B.改進組

湖州市第一人民醫(yī)院采用獲取樣本后立即用生理鹽水濕潤的紗布包裹，并放入保溫冷藏箱中半小時內(nèi)轉(zhuǎn)運至病理科，技術(shù)員接收樣本后，采用改進法分三步制片，有效保障切片上有腎小球及切片質(zhì)量。

傳統(tǒng)法未有效區(qū)分腎組織皮質(zhì)和髓質(zhì)，經(jīng)常需要二次取組織再切片，不僅造成組織浪費，也增加了制片成本。本研究改進了組織截取方法，先借助手機攝像頭的放大功能區(qū)分皮質(zhì)和髓質(zhì)，再用切片刀從皮質(zhì)端截取組織做冷凍切片，提高了腎小球切出率。

由于腎穿刺樣本送檢時需用含生理鹽水的紗布包裹，組織表面會吸附較多水分，傳統(tǒng)法沒有將組織表面吸附的多余水分清除，冷凍后導(dǎo)致組織變硬、變脆，組織容易與包埋劑分離，切片碎裂。此外，還需預(yù)切15～18 張冷凍切片備用，切片過程耗時長，且冷凍溫度過低（–22～–20℃），長時間冷凍組織易變硬、變脆，也會造成切片出現(xiàn)碎裂狀的現(xiàn)象[15]。本研究改進了腎穿刺樣本的前處理過程，通過冷凍前采用吸水棉紙吸取腎組織表面多余水分，使包埋劑與組織充分結(jié)合，可簡便有效地解決組織與包埋劑分離的現(xiàn)象。此外，根據(jù)腎組織的特點將箱體及樣本夾溫度控制在–17℃[16]，能夠改善長時間冷凍后切片易碎裂的現(xiàn)象，較順利的完成連續(xù)多張高質(zhì)量的切片。

冷凍穿刺組織的傳統(tǒng)法包埋沒有平整的支撐平臺，組織很難包在同一水平面，造成切片不完整及修切時組織損失過多[16-20]。本研究改進了腎穿刺樣本的包埋方式，預(yù)先準(zhǔn)備包埋平臺，再將組織平放在已修平的包埋劑平臺上，并按組織長軸與刀口平行的方向擺放，再加包埋劑包裹組織，從而能同時、完整的切到整條組織。

綜上所述，對比兩種腎穿刺樣本冰凍制片方法，改進法的腎小球切出率為100%，顯著高于傳統(tǒng)法腎小球切出率（82.14%）；改進法切片優(yōu)良率為96.43%，顯著高于傳統(tǒng)法切片優(yōu)良率（71.43%）。通過改進方法，提高了腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率，對臨床應(yīng)用有較大的指導(dǎo)意義，具有一定的推廣價值。

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Study of quality improvement of frozen sections of renal puncture samples

Department of Pathology, the First People’s Hospital of Huzhou, Huzhou 313000, Zhejiang, China

To improve the glomerular detection rate and the excellent rate of frozen sections of renal puncture samples.Kidney puncture tissues of 28 clinical patients in the First People’s Hospital of Huzhou from September to December 2021 were selected.By improving the methods of freezing, embedding and sectioning of renal puncture samples, the glomerular detection rate and the excellent rate of sectioning were improved.The glomerular detection rate of the improved method (100%) was significantly higher than that of the traditional method (82.14%) (2=5.490,=0.026); The excellent rate of the improved method (96.43%) was significantly higher than that of the traditional method (71.43%) (2=8.347,=0.004).By improving the method, glomerular detection rate and the excellent rate of frozen sections of renal puncture samples were increased, and has the value of clinical application.

Renal puncture samples; Frozen section; Improvement method

R365

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.002

浙江省教育廳科研項目（Y202043861）；湖州市科技計劃項目（2020GYB13）

崔戈，電子信箱：witcui@qq.com

（2022–08–08）

（2022–12–28）