免疫組織化學染色檢測肺結核組織中的Ag85B

方詩宇,段紹琪,陳雪倩,于江,孫杰,劉鳳君

(川北醫學附屬醫院感染科,四川 南充 637000)

結核病是對人類威脅最大的傳染病之一,由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染所致。世界衛生組織《2021年全球結核病報告》[1]指出,2020年估計有990萬新發結核病例,雖然很多國家加強了防控,但結核病的疫情仍呈反彈的趨勢,約300萬結核病患者未及時得到診斷和治療。由于結核病可以治愈,因此早期診斷、及時治療對于終止結核病的傳播非常關鍵。

肺結核是結核病中最常見的類型,其診斷方法主要有影像學、免疫學、病原學、病理學等[2],根據中華人民共和國衛生行業標準—《肺結核診斷》(WS288-2017)[3],以病原學和病理學作為確診依據,其中病原學包括細菌學(抗酸菌涂片鏡檢、結核分枝桿菌培養)及分子生物學。但敏感性不能滿足臨床需要。特異性抗原也是病原微生物感染的診斷依據之一,2017年《中國結核病病理學診斷專家共識》[4]指出,采用免疫組織化學染色(immunohistochemical staining,IHC)的方法檢測結核病變組織中MTB特異性抗原的表達對結核病的診斷有幫助。

Ag85B是MTB的主要分泌抗原之一,其表達量高[5],目前已有研究發現利用IHC可以檢測到肺結核、淋巴結及腎結核組織中Ag85B的表達。但有關研究較少,且由于目前尚無可應用于臨床診斷的免疫組化特異性抗體及統一的判讀標準,需要開展更多的臨床轉化及評估研究。因此,本研究通過免疫組織化學染色檢測石蠟包埋肺組織標本中Ag85B的表達情況,并與抗酸染色比較,了解其對于肺結核的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年5月至2021年8月于川北醫學院附屬醫院手術切除的19例經病理診斷為肺結核且已行抗酸染色的石蠟包埋肺組織標本為研究對象。納入標準:符合2017年《中國結核病病理學診斷專家共識》[4]I類或Ⅱ類診斷標準,且術后抗結核治療有效。以非肺結核肺組織(肺癌切除標本正常組織斷端)20例為陰性對照。

1.2 方法

1.2.1 試劑 Ag85B兔多克隆抗體(bs-9268R)購于北京博奧森古生物技術有限公司。檸檬酸組織抗原修復液(100×)購于北京博奧森古生物技術有限公司。即用型免疫組化SP試劑盒購于福州邁新生物技術有限公司。DAB顯色試劑盒(20×)購于福州邁新生物技術有限公司。

1.2.2 HE染色 石蠟切片經脫蠟后置于梯度酒精中各3 min,然后蒸餾水洗 1min;蘇木素染色5～10 min后流水洗1 min,置于1%鹽酸-乙醇中3 s,水洗2 s;1%氨水返藍5～10 s,流水洗2 min,蒸餾水水洗2 min;0.5%伊紅染色1～3 min,蒸餾水水洗2 s;梯度酒精脫水各3 min;最后置于二甲苯(I、II、III)中各5 min,吹干后中性樹膠封片。

1.2.3 免疫組織化學染色 采用SP法。一抗為Ag85B兔多克隆抗體,稀釋比例1:300;二抗為生物素標記的羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物。病理切片首先進行HE染色,由病理醫生復檢核實存在結核病灶。所有切片均行脫蠟、抗原修復,操作步驟按免疫組化試劑盒說明書進行,DAB染色室溫孵育5 min,蘇木素染色30 s,1%鹽酸-乙醇分化2 s,蒸餾水水洗,梯度酒精脫水,吹干后中性樹膠封片。每批染色使用PBS溶液代替一抗設置陰性對照。陽性結果:IHC染色陽性結果為棕色顆粒,著色部位中心顏色較深,周圍較淺。

1.3 統計學分析

采用SPSS22.0 軟件進行數據處理和分析。計數資料以[n(%)]表示,組間比較以Fisher精確概率法分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺結核組織中Ag85B的表達特點

選取的19例肺結核標本均已由本院病理科行抗酸染色。選擇抗酸染色(+++)的標本進行Ag85B的免疫組化染色,并通過與HE及抗酸染色對比以了解抗原陽性信號的分布特點。如圖所示:肺結核組織切片經HE染色可見慢性肉芽腫改變,伴凝固型壞死;抗酸染色后可見大量紅色桿狀、細長略彎曲的抗酸桿菌,主要分布在干酪樣壞死區及周圍與肉芽腫交界處;Ag85B的免疫組化染色陽性信號為棕色顆粒物,主要沉積在壞死灶及其周圍,與抗酸染色比較可見Ag85B蛋白的分布與抗酸桿菌相關,范圍更廣。而陰性對照的免疫組化染色未見陽性信號或僅可見少許棕色信號,染色較肺結核組淺,且分布無特殊規律。見圖1。

2.2 免疫組化檢測Ag85B及抗酸染色的結果

19例肺結核組織標本中Ag85B免疫組化陽性16例,陰性3例,敏感度為84.21%;抗酸染色陽性10例,陰性9例,敏感度為52.63%。20例正常肺組織標本中,Ag85B檢測陽性3例,陰性17例,其特異度為85.00%;抗酸染色檢測陽性0例,陰性20例,特異度為100.00%。免疫組化的陽性和陰性預測值分別為84.21%、85.00%;抗酸染色的陽性及陰性預測值分別為100.00%、68.97%。見表1。

表1 免疫組化檢測Ag85B蛋白及抗酸染色的結果

2.3 免疫組化染色與抗酸染色檢測結果對比

19例肺結核標本中,10例抗酸染色陽性,9例抗酸染色陰性,抗酸染色敏感度為52.63%(10/19)。Ag85B蛋白的免疫組織化學染色結果如下:10例抗酸染色陽性的標本中,Ag85B的免疫組化染色全部陽性;9例抗酸陰性的標本中,6例免疫組化呈陽性,因此Ag85B的敏感度為84.21%(16/19)。與抗酸染色相比,免疫組化敏感性提高31.58%,差別有統計學意義(P=0.039)。采用同樣的統計學方法,依次對兩種檢測手段的特異度、陽性預測值及陰性預測值進行對比,二者差異均無統計學意義(P=0.115,P=0.265,P=0.173)。

3 討論

病理學檢查是結核病的重要診斷手段之一,結核典型的大體標本呈灰黃色的干酪樣壞死,而鏡下典型的病變是肉芽腫伴干酪樣壞死,外周有纖維結締組織和慢性炎癥細胞浸潤,病變周邊可見朗格漢斯巨細胞[6]。需要注意的是,結核病的大體觀察、組織學表現及細胞學表現雖然具有一定的特異性,但所有上述表現亦可出現在其他感染性和非感染性肉芽腫性病變中[3],且仍有14%的結核病未出現壞死性病變[7]。所以常規的病理學特點結合病原學依據對于確診結核的價值更大。在壞死性肉芽腫基礎上行抗酸染色經濟、簡便,是目前臨床尋找MTB最常用的方法,但抗酸染色敏感性較低[8-9],目前不能滿足臨床需要,且需使用高倍鏡及油鏡,尋找抗酸桿菌費時費力。近年來,分子病理學檢測技術發展迅速,雖敏感性較抗酸染色有所提高,但可能因氣溶膠污染容易出現假陽性結果[10],對實驗室及操作人員有較高的要求,在結核病負擔較重的發展中國家難以廣泛開展。

隨著對結核病免疫機制的深入研究,一些結核分支桿菌抗原為結核診斷提供了新思路。近年來,研究發現采用IHC的方法可以檢測出在結核病變組織切片中MTB特異性抗原的表達,對結核病的診斷有參考價值。目前的研究主要針對MPT64、ESAT-6、Ag85B等MTB分泌性抗原,但相關研究均較少,更重要的是由于目前尚無可應用于臨床診斷的特異性抗體及統一的判讀標準,專業人員呼吁開展更多的臨床轉化及評估研究。本實驗采用免疫組化法檢測肺結核組織中的Ag85B蛋白,發現抗原陽性信號沉積在結核壞死灶及其周圍,分布與抗酸桿菌有關,范圍更廣,符合Ag85B作為分泌性抗原不僅存在細胞內,也分泌到細胞周圍的特點。與車南穎等[11]、Wang等[12]的研究結果相似,以上結果提示免疫組化檢測Ag85B可用于結核的診斷。

本研究發現在抗酸染色陽性的10例標本中,Ag85B免疫組化均為陽性,在抗酸染色陰性的9例標本中仍有6例為陽性,其敏感度為84.21%,遠遠高于抗酸染色的52.63%。20例正常肺組織標本中,Ag85B檢測陽性3例,特異度為85.00%。前期研究[13-16]報道Ag85B的敏感性為39.3%～64.4%,而特異性均為100%。敏感性和特異性的差異可能與組織來源的不同有關,也可能與IHC結果判讀標準不完全一致有關。本研究中陰性對照的陽性信號弱且分布無規律,如果提高陽性信號的強度并把分布規律納入陽性判定標準,特異性即為100%,但敏感性可能會降低。因此,該方法的臨床應用嗜需臨床醫生、病理專家等相關專業人士統一判定標準。雖然不同研究的結果有差異,但大部分實驗結果提示免疫組化的敏感性高于抗酸染色,且免疫組織化學陽性信號易于觀察,可以有效提高工作效率。因此Ag85B的免疫組化在結核診斷中具有潛在的應用價值,與其他抗原聯合檢測意義更大。