大黃素對膝骨關節炎大鼠軟骨細胞鐵死亡的影響及機制研究

王柯，葉寒露

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是導致老年患者殘疾的最常見退行性關節疾病，發病機制復雜，以膝關節軟骨退變、破壞和骨質增生為主要特征，治療方案包括手術和非手術兩種，且后者已成為近年研究的熱點［1］。研究顯示，青蒿素、大黃素等中藥單體治療KOA可取得良好療效［2］。大黃素是從大黃的根莖中分離出來的天然蒽醌類化合物，具有抗菌、抗癌和抗炎等多種藥理活性，可通過抗基質降解途徑保護KOA 大鼠膝關節軟骨［3］。目前，有關大黃素保護KOA 膝關節軟骨的作用機制尚不明確。鐵死亡是以鐵失衡和脂質過氧化為特征的細胞死亡方式，在骨質疏松癥等骨疾病的發生中發揮重要作用［4］。有研究認為，抑制軟骨細胞鐵死亡、激活核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）通路活化可減輕KOA中軟骨細胞損傷［5］。大黃素能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路來抑制脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥和氧化應激［6］。基于此，筆者推測大黃素可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路來抑制KOA 大鼠軟骨細胞鐵死亡，從而保護膝關節軟骨。本研究通過構建KOA大鼠模型并采用大黃素干預，觀察軟骨細胞鐵死亡變化及Nrf2/HO-1信號通路在此過程中的作用，從而探索大黃素治療KOA的分子機制，為大黃素用于KOA治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級健康雄性SD大鼠96只，10～12周齡，體質量（350±20）g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。所有大鼠在（25±1）℃、相對濕度60%～65%的環境下飼養，每天12 h 光照∶12 h 黑暗，自由攝食飲水。本研究動物實驗嚴格遵循3R原則并經過武漢市中醫醫院實驗動物倫理委員會批準（批準號：2021005）。大黃素（美國Sigma 公司）；Nrf2 抑制劑ML385（美國MCE 公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA試劑盒（江西艾博因生物科技有限公司）；改良番紅O-固綠軟骨染色液（北京索萊寶科技有限公司）；原位末端標記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、亞鐵離子（Fe2+）比色法測試盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）熒光法測試盒（DCFH-DA，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；兔抗鼠Ⅱ型膠原α1（collagen type Ⅱα1，COL2A1）抗體（上海聯邁生物工程有限公司）；兔抗鼠基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3 抗體、兔抗鼠MMP-13、兔抗鼠前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）抗體、兔抗鼠谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體、兔抗鼠Nrf2抗體、兔抗鼠甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、兔抗鼠Histone H3 抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG（英國Abcam 公司）；長鏈脂酰輔酶A 合成酶4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）、HO-1抗體（美國Invitrogen公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 模型構建與分組干預 大鼠適應性飼養2周后按隨機數表法分為假手術（Sham）組、KOA 組、大黃素（EMO）組、大黃素+Nrf2 抑制劑（EMO+ML385）組，每組24 只。除Sham 組外，其余組大鼠采用改良Hulth法構建KOA模型［7］：大鼠仰臥位固定，麻醉后從膝關節內側入路，將內側副韌帶切斷，摘除內側半月板，并切斷前交叉韌帶。Sham組僅打開關節腔，韌帶和半月板均保持完整。整個造模過程均保持無菌，術中實時監測大鼠的呼吸和心率，術后連續3 d肌內注射20萬U 青霉素。大鼠醒來后正常喂食飲水，并自由走動。從造模第4周開始，EMO 組大鼠腹腔注射80 mg/kg 大黃素［3］；EMO+ML385 組大鼠腹腔注射80 mg/kg 大黃素和30 mg/kg ML385［8］；Sham 組、KOA 組分別注射等量生理鹽水和二甲基亞砜（dimethyl surfoxide，DMSO）的混合物（大黃素、ML385 均經DMSO溶解后使用生理鹽水稀釋），1次/d，連續3周。

1.2.2 ELISA檢測血清TNF-α、NO、PGE2水平 各組大鼠麻醉后于腹主動脈取血4 mL，3 500 r/min離心10 min，取上層血清并于-20 ℃冰箱保存。每組隨機取8 只大鼠的血清，參照ELISA 試劑盒說明書用酶標儀測定450 nm 波長處光密度（OD）值，繪制標準曲線，根據曲線方程計算各組大鼠血清炎性因子TNF-α、NO、PGE2水平。

1.2.3 膝關節形態觀察 取血后處死大鼠，肉眼觀察患肢膝關節軟骨、滑膜的顏色、形態等大體情況。番紅O-固綠染色觀察膝關節軟骨組織病理形態學變化：每組隨機取8只大鼠患肢膝關節并于4%多聚甲醛固定24 h，以10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣處理2周，脫水、透明后石蠟包埋并切片（厚度5 μm）。石蠟切片脫蠟至水，Weigent 染液染色5 min，酸性乙醇分化后固綠染液染色5 min，蒸餾水沖洗后Safranin O染液孵育2 min。在顯微鏡下觀察拍照（軟骨基質呈紅色）。并根據關節軟骨組織的結構、著色程度及軟骨細胞的分布、壞死程度等進行國際骨關節炎研究協會（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）評分［9］，總分越高膝關節炎程度越嚴重。

1.2.4 TUNEL染色檢測膝關節軟骨細胞凋亡率 取1.2.3中制備的石蠟切片，脫蠟至水后添加蛋白酶K 于37 ℃孵育15 min，添加TUNEL 反應混合液于37 ℃避光孵育1 h，DAPI染核，熒光顯微鏡觀察并采集圖像。隨機讀取6 個視野，Image J 軟件統計TUNEL 陽性染色細胞（即凋亡細胞，呈紅色）和總細胞（呈藍色），計算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 mRNA 表達水平 每組隨機取8只大鼠的患肢膝關節置于-80 ℃冰箱保存。取出每只大鼠部分膝關節軟骨，使用Trizol 試劑提取組織中總RNA 并將其反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板配制反應體系（20 μL）：50 mg/L cDNA 2 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，SYBR Green Mix 10 μL，無菌ddH2O 6 μL。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個循環。獲取循環閾值（Ct 值）。以GAPDH 為內參基因，2-ΔΔCt法計算MMP-3、MMP-13、COL2A1 及PTGS2 的mRNA 相對表達水平。

Tab.1 Primer sequence表1 引物序列

1.2.6 生化試劑盒檢測膝關節軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平 每組取剩余8只大鼠的患肢膝關節制備新鮮軟骨組織勻漿液，12 000 r/min 離心15 min 獲取上清液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白濃度后，參照各自測試盒說明書，使用酶標儀或分光光度計檢測MDA（波長532 nm）、ROS（激發波長500 nm，發射波長525 nm）及GSH（波長412 nm）、Fe2+（波長593 nm）水平。

1.2.7 免疫組化染色檢測膝關節軟骨組織中GPX4、ACSL4陽性表達 取1.2.3中制備的膝關節軟骨組織行常規石蠟切片，脫蠟至水后滴加3%過氧化氫以滅活內源性過氧化物酶，置于枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸以行抗原熱修復，正常山羊血清封閉后滴加一抗GPX4（1∶100）、ACSL4（1∶500），4 ℃孵育過夜，滴加生物素標記二抗（1∶4 000）37 ℃孵育1 h，DAB 試劑顯色，蘇木精染核。在顯微鏡下觀察拍照（陽性染色細胞呈棕褐色或棕黃色），使用Image J 軟件計數陽性染色細胞數目，計算陽性細胞比例。

1.2.8 蛋白免疫印跡檢測膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2、GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1 蛋白表達水平 取出-80 ℃冰箱保存的剩余部分膝關節軟骨，使用RIPA裂解液提取組織中總蛋白，細胞核和質提取試劑盒分離胞核和胞質蛋白，BCA法定量蛋白濃度。每泳道上樣20 μg變性蛋白（20 μL）進行凝膠電泳，切膠后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封閉膜2 h，膜與一抗MMP-3（1∶2 000）、MMP-13（1∶3 000）、COL2A1（1∶1 500）及PTGS2、GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1、Histone H3（均1∶1 000）、GAPDH（1：10 000）4 ℃孵育過夜，與HRP 標記羊抗兔IgG（1∶5 000）37 ℃孵育45 min，化學發光試劑顯色。MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2、GPX4、ACSL4、胞質Nrf2、HO-1 以GAPDH為內參，胞核Nrf2 以Histone H3 為內參，凝膠成像系統掃描圖像后使用Image J軟件分析蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、NO 以及PGE2 水平比較 與Sham 組比較，KOA 組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2 水平升高（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2 水平降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2水平升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum TNF-α,NO and PGE2 levels between the four groups of rats表2 各組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2水平比較（n=8,）

Tab.2 Comparison of serum TNF-α,NO and PGE2 levels between the four groups of rats表2 各組大鼠血清TNF-α、NO、PGE2水平比較（n=8,）

＊＊P＜0.01；a與Sham 組比較，b與KOA 組比較，c與EMO 組比較，P＜0.05；表3—8同。

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2.2 各組大鼠膝關節大體形態和軟骨組織病理形態學 Sham組大鼠關節軟骨表面光滑，滑膜未見肥厚，軟骨細胞排列整齊、呈紅色染色，潮線清晰；KOA組大鼠關節軟骨表面不規則且粗糙有裂紋，滑膜明顯增厚，軟骨層變薄并出現裂隙樣破壞，存在肥大的軟骨細胞；EMO 組大鼠關節軟骨表面更加光滑，裂紋減少，滑膜增厚減輕，軟骨層變厚且裂隙樣破壞明顯改善；EMO+ML385 組大鼠關節軟骨破壞較EMO組加重，見圖1、2。與Sham 組比較，KOA 組大鼠OARSI 評分升高（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠OARSI 評分降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠OARSI 評分升高（P＜0.05），見表3。

Fig.1 General morphology of knee joint of rats in each group圖1 各組大鼠膝關節大體形態

Fig.2 Pathological changes of knee joint cartilage tissue of rats in each group(safranine O-solid green staining,×200)圖2 各組大鼠膝關節軟骨組織病理形態學變化（番紅O-固綠染色，×200）

Tab.3 Comparison of OARSI score of knee joint cartilage and apoptosis rate of chondrocytes between the four groups of rats表3 各組大鼠膝關節軟骨OARSI評分和軟骨細胞凋亡率比較（n=8,）

Tab.3 Comparison of OARSI score of knee joint cartilage and apoptosis rate of chondrocytes between the four groups of rats表3 各組大鼠膝關節軟骨OARSI評分和軟骨細胞凋亡率比較（n=8,）

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2.3 各組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡情況 與Sham組比較，KOA 組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與KOA組比較，EMO組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率升高（P＜0.05），見表3、圖3。

2.4 各組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 mRNA 相對表達水平比較 與Sham組比較，KOA 組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2 mRNA 相對表達水平升高，COL2A1 mRNA 相對表達水平降低（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2 mRNA 相對表達水平降低，COL2A1 mRNA 相對表達水平升高（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2 mRNA 相對表達水平升高，COL2A1 mRNA 相對表達水平降低（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 mRNA relative expression levels in knee joint cartilage between the four groups of rats表4 各組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 mRNA相對表達水平比較(n=8,)

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2.5 各組大鼠膝關節軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平比較 與Sham 組比較，KOA 組大鼠膝關節軟骨組織中MDA、ROS、Fe2+水平升高，GSH 水平降低（P＜0.05）；與KOA組比較，EMO組大鼠膝關節軟骨組織中MDA、ROS、Fe2+水平降低，GSH 水平升高（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關節軟骨組織中MDA、ROS、Fe2+水平升高，GSH 水平降低（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of MDA,ROS,GSH and Fe2+levels in knee joint cartilage of rats between the four groups表5 各組大鼠膝關節軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平比較（n=8，）

Tab.5 Comparison of MDA,ROS,GSH and Fe2+levels in knee joint cartilage of rats between the four groups表5 各組大鼠膝關節軟骨組織中MDA、ROS、GSH、Fe2+水平比較（n=8，）

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2.6 各組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、ACSL4 陽性細胞比例比較 Sham 組可見大量呈棕褐色或棕黃色的GPX4 陽性細胞，少量呈棕褐色或棕黃色的ACSL4 陽性細胞；與Sham 組比較，KOA 組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4 陽性細胞比例降低，ACSL4 陽性細胞比例升高（P＜0.05）；與KOA組比較，EMO組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4 陽性細胞比例升高，ACSL4 陽性細胞比例降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4 陽性細胞比例降低，ACSL4 陽性細胞比例升高（P＜0.05），見表6、圖4。

Tab.6 Comparison of the proportion of GPX4 and ACSL4 positive cells in knee joint cartilage between the four groups of rats表6 各組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、ACSL4陽性細胞比例比較（n=8，%，）

Tab.6 Comparison of the proportion of GPX4 and ACSL4 positive cells in knee joint cartilage between the four groups of rats表6 各組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、ACSL4陽性細胞比例比較（n=8，%，）

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2.7 各組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2 蛋白相對表達水平比較 與Sham組比較，KOA 組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2蛋白相對表達水平升高，COL2A1蛋白相對表達水平降低（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2蛋白相對表達水平降低，COL2A1蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、PTGS2蛋白相對表達水平升高，COL2A1蛋白相對表達水平降低（P＜0.05），見圖5、表7。

Fig.5 Protein expression of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 in knee joint cartilage of rats in each group圖5 各組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2蛋白表達

Tab.7 Comparison of the protein relative expression levels of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 in knee joint cartilage between the four groups of rats表7 各組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2蛋白相對表達水平比較（n=8,）

Tab.7 Comparison of the protein relative expression levels of MMP-3,MMP-13,COL2A1 and PTGS2 in knee joint cartilage between the four groups of rats表7 各組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、MMP-13、COL2A1、PTGS2蛋白相對表達水平比較（n=8,）

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2.8 各組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1 蛋白相對表達水平比較 與Sham 組比較，KOA 組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、胞質Nrf2蛋白相對表達水平降低，ACSL4、胞核Nrf2、HO-1蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與KOA 組比較，EMO 組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、胞核Nrf2、HO-1 蛋白相對表達水平升高，ACSL4、胞質Nrf2 蛋白相對表達水平降低（P＜0.05）；與EMO 組比較，EMO+ML385 組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、胞核Nrf2、HO-1 蛋白相對表達水平降低，ACSL4、胞質Nrf2蛋白相對表達水平升高（P＜0.05），見圖6、表8。

Tab.8 Comparison of the protein relative expression levels of GPX4,ACSL4,Nrf2 and HO-1 in knee joint cartilage of rats between the four groups表8 各組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1蛋白相對表達水平比較（n=8,）

Tab.8 Comparison of the protein relative expression levels of GPX4,ACSL4,Nrf2 and HO-1 in knee joint cartilage of rats between the four groups表8 各組大鼠膝關節軟骨組織中GPX4、ACSL4、Nrf2、HO-1蛋白相對表達水平比較（n=8,）

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3 討論

KOA 為一種退行性慢性關節疾病，主要損害關節軟骨，導致關節周圍疼痛、腫脹和僵硬，是誘發殘疾主要原因，且隨著人口老齡化和肥胖患病率的增加，其患病率亦逐漸升高［10］。研究顯示，大黃素在體外和體內均可通過抑制NF-κB 和Wnt/β-catenin 信號通路改善KOA 中軟骨退化［11］。大黃素通過抑制ERK 和Wnt/β-catenin 通路下調軟骨細胞中一系列炎癥介質的表達，促進軟骨細胞增殖［12］。大黃素可減少軟骨基質的降解，保護膝關節軟骨［4］。此外，炎癥反應在KOA的發病機制中起重要作用，受損的軟骨細胞、滑膜細胞可在炎性因子誘導下釋放炎性介質和酶類等，從而加速軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解和軟骨損傷、退化，故KOA發生時表現為軟骨組織、關節液及血清中炎性介質均呈高水平［13-14］。本研究結果顯示，KOA 模型大鼠血清炎性介質（TNF-α、NO、PGE2）水平以及膝關節軟骨組織OARSI評分、ECM降解酶（MMP-3、MMP-13）mRNA 和蛋白相對表達水平較Sham 組升高，同時軟骨細胞分泌的ECM 主要成分COL2A1 的mRNA 和蛋白相對表達水平降低，且膝關節軟骨明顯破壞；而大黃素可降低KOA 大鼠血清TNF-α、NO、PGE2 水平以及OARSI 評分，抑制MMP-3、MMP-13表達并促進COL2A1表達，同時明顯改善膝關節軟骨破壞，表明大黃素可減輕炎癥反應，緩解軟骨基質降解，進而對KOA大鼠膝關節軟骨發揮保護作用，與既往研究結果［4,11-12］相一致。

軟骨細胞作為關節軟骨中唯一的細胞組成成分，主要通過平衡ECM的合成和降解來維持軟骨的完整，故軟骨細胞損傷是骨關節炎進展中的一個重要問題。研究表明，軟骨細胞鐵死亡可促進骨關節炎的進展［15］。在鐵死亡途徑中，鐵依賴性的MDA等脂質過氧化物的生成、細胞內GSH消耗和ROS的蓄積是鐵死亡的必要條件和基本特征，PTGS2、GPX4、ACSL4等是鐵死亡的關鍵調節因子［16］。本研究結果顯示，KOA 模型大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率以及組織中MDA、ROS、Fe2+水平、PTGS2 mRNA和蛋白相對表達、ACSL4 陽性細胞比例和蛋白相對表達水平均升高，同時GSH水平、GPX4陽性細胞比例和蛋白表達水平降低，表明本研究構建的KOA模型大鼠膝關節軟骨細胞發生鐵死亡。大黃素干預治療后，KOA大鼠膝關節軟骨細胞凋亡率及MDA、ROS、Fe2+水平和PTGS2、ACSL4表達均降低，同時GSH水平、GPX4表達升高，表明大黃素對KOA大鼠膝關節軟骨細胞鐵死亡具有一定改善作用，提示大黃素可能通過抑制KOA 大鼠軟骨細胞鐵死亡，減輕膝關節軟骨退化，進而發揮保護膝關節軟骨作用。李哲等［17］通過生物信息學分析與實驗驗證亦發現，靶向抑制鐵死亡或許是一種較快且有效延緩骨關節炎中軟骨退變的方法。

研究表明，藥用植物及其次級代謝產物可通過NF-κB、Nrf2等信號通路以及細胞凋亡、焦亡和鐵死亡等細胞死亡模式，發揮抗KOA作用［18］。Nrf2/HO-1 信號通路是機體調節氧化應激的重要信號通路，正常情況下，Nrf2 與其抑制蛋白Keap1 以二聚體形式存在于細胞質中，而當其受到外界不利環境刺激后，Nrf2與Keap1解離活化，進入細胞核，促進SOD、HO-1 等Nrf2 下游：靶基因表達，發揮抗氧化作用［19］。研究顯示，激活Nrf2/HO-1 信號通路能夠保護滑膜細胞并減輕KOA［20］。此外，激活Nrf2/HO-1信號通路能夠抑制2型糖尿病性骨質疏松癥中高糖誘導的成骨細胞鐵死亡［21］。本研究中，KOA模型大鼠膝關節軟骨組織中胞核Nrf2、HO-1蛋白相對表達水平升高，同時胞質Nrf2蛋白相對表達水平降低，表明KOA 發生后Nrf2/HO-1 信號通路被激活，緩解了膝關節軟骨組織氧化應激損傷，但其抗氧化應激能力有限，所以膝關節軟骨組織仍存在較嚴重的病理損傷。大黃素干預治療后，KOA 大鼠膝關節軟骨組織中胞核Nrf2、HO-1 蛋白相對表達水平進一步升高，同時胞質Nrf2蛋白相對表達水平進一步降低，表明大黃素可能通過促進KOA 大鼠膝關節軟骨組織中Nrf2/HO-1信號通路激活，抑制軟骨細胞鐵死亡。另有文獻報道，大黃素通過激活Nrf2/HO-1 通路減輕炎癥和氧化應激，保護敗血癥相關的腸黏膜屏障損傷［22］。ML385 既是Nrf2 的特異性抑制劑，也是鐵死亡的激活劑［23］。本研究進一步分析發現，ML385可抑制Nrf2/HO-1 通路激活，減弱大黃素對KOA 大鼠膝關節軟骨組織損傷和軟骨細胞鐵死亡的改善作用。以上這些結果表明，大黃素可能通過激活Nrf2/HO-1 通路抑制軟骨細胞鐵死亡，保護KOA 大鼠膝關節軟骨。

綜上所述，大黃素可抑制KOA大鼠軟骨細胞鐵死亡，保護膝關節軟骨，其作用機制可能與促進Nrf2/HO-1 信號通路激活有關。大黃素是一種很有前景的預防和治療KOA的藥物，但本研究僅通過體內動物實驗進行了初步驗證，后續將就軟骨組織和關節液中炎性介質水平等進行深入分析。