亞低溫治療對豬心臟驟停體外心肺復蘇后免疫功能及神經功能的影響

王晉祥，續國武，王太蘭，王樂，靳衡，柴艷芬△

心臟驟停（cardiac arrest，CA）是患者死亡的重要原因之一。最新研究顯示，我國每年因CA死亡人數高達103 萬例，而院外心臟驟停（out of hospital cardiac arrest,OHCA）出院存活率及神經功能良好的比例僅為1.3%和1%［1］。體外心肺復蘇（ECPR）與傳統心肺復蘇（CPR）相比有著更高的成功率，如能在CA 后30 min 內實施ECPR，患者存活率可提高至40%［2］。 目標體溫管理（target temperature management，TTM）已被證實是改善CA 患者生存率及神經功能預后的重要干預措施［3］。目前關于亞低溫治療（MHT）對ECPR后神經功能影響的基礎性研究較少，而對免疫功能是否存在抑制作用尚存在諸多爭議。本研究通過探討MHT 對豬心臟驟停體外心肺復蘇后免疫功能及神經功能的影響，旨在為CA患者ECPR后的MHT提供相關理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物與分組 健康實驗巴馬香豬18只，由天津中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（津）2020-0005，體質量35～45 kg。實驗前禁食24 h，不禁水。采用隨機數字表法將其分為假手術（Sham）組、常溫治療（NT）組和MHT組，每組6只。NT組和MHT組經右心室誘顫建立CA模型，隨后采取ECPR與體溫管理；Sham組僅進行常規麻醉、氣管插管與CA模型置管。

1.1.2 實驗設備 實驗ECMO 系統，包括：滾壓式血泵、WEL-1000Wplus 熱交換水箱（天津匯康公司）；膜式氧合器、配套管路及15 F 股動脈插管、17 F 股靜脈插管（德國Maquet公司）；心電監護儀、大動物呼吸麻醉一體機、纖維支氣管鏡、除顫儀、心肺復蘇機、手術床、吊塔吊燈、控溫毯（邁瑞醫療）；便攜式超聲儀（Philips）；高頻電刀及電凝設備（北京索吉瑞）；外科手術器械。

1.2 方法

1.2.1 麻醉及術前準備 實驗豬稱體質量后給予戊巴比妥鈉30 mg/kg肌內注射，誘導麻醉成功后丙泊酚4～6 mg/（kg·h）持續泵入維持麻醉。經纖維支氣管鏡輔助下氣管插管，呼吸機輔助機械通氣（潮氣量10 mL/kg，頻率15次/min，吸入氧濃度40%）；同時輔以1%～3%異氟烷持續吸入麻醉。床旁超聲引導下一側股動脈置入4 F動脈測壓導管進行脈搏指數連續心輸出量監測（PICCO）實時監測有創血壓及血溫變化。乳酸鈉林格、5%葡萄糖氯化鈉注射液10～15 mL/（kg·h）交替持續靜脈補液。

1.2.2 體外膜肺氧合（ECMO）安裝與預充 ECMO管路采用無菌生理鹽水預充。預充完畢后調整為待機狀態。ECMO導管置入：床旁超聲引導下行股動靜脈穿刺置管，動脈插管置管深度10～15 cm，靜脈插管置管深度30～45 cm（以導管尖端達右心房為準）。確認插管位置后用管道鉗夾閉，靜脈注射1 mg/kg肝素鈉預抗凝，妥善縫合固定。

1.2.3 建立CA模型 床旁超聲引導下經頸內靜脈將雙極起搏電極送入右心室，當電極置入深度18～22 cm 時，心電監護儀提示出現室性期前收縮或室性心動過速，提示電極位置抵達右心室心內膜。開始予以電流刺激（9 V直流電），持續3～5 s，參照評估標準［4］（出現室顫心律，收縮壓下降至25 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）確認成功誘導室顫致CA 后停止機械通氣，觀察5～10 min，期間不予任何干預，隨后啟動ECPR搶救流程。

1.2.4 實施ECPR 持續胸外按壓，頻率120 次/min，按壓深度3～4 cm；立即恢復機械通氣（吸入氧濃度100%，余參數同前）；實施非同步直流電擊除顫（雙向200 J），間斷給予腎上腺素、胺碘酮直至心搏恢復，重新建立循環。同時將股動脈、股靜脈插管分別連接預充好的ECMO 管路，ECMO 流量調整為20～40 mL/（kg·min），氧流量調整為1.0～1.5 mL/min。維持平均動脈壓＞65 mmHg，整個過程持續補液并監測電解質及酸堿平衡。

1.2.5 TTM 各組動物均處在恒定室溫25 ℃下進行；MHT組通過ECMO 變溫水箱將目標溫度保持32～36 ℃；NT 組通過ECMO 變溫水箱將目標溫度保持37 ℃；Sham 組采用控溫毯將目標體溫保持37 ℃；MHT 組治療24 h 后通過變溫水箱以0.5 ℃/h 速度復溫2～10 h，然后對各組進行神經功能缺損（NDS）評分，最后按倫理規定處死動物。

1.2.6 標本收集與指標檢測 采集各組動物靜脈血10 mL，3 000 r/min 離心15 min，分別取血清和血漿待檢。采用放射免疫分析法測定IgM、IgA、IgG含量。采用流式細胞儀測定T細胞亞群CD4、CD8、CD4/CD8水平。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定神經元特異性烯醇化酶（NSE）和S100B 蛋白表達水平。試劑盒購自北京沃萊士生物科技有限公司，標本儲存和實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法 使用SPSS 20.0 進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。計數資料比較采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組實驗前基礎參數對比 各組動物實驗前體質量、中心體溫、血流動力學參數（心率和平均動脈壓）、呼吸頻率比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。其中NT 組和MHT 組均成功經右心室誘顫制作CA 模型，并全部成功實施ECPR，復蘇成功率100%。

Tab.1 Comparison of basic parameters before experiment between the three groups表1 各組實驗前基礎參數比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of basic parameters before experiment between the three groups表1 各組實驗前基礎參數比較（n=6，）

均P＞0.05。

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2.2 各組神經功能評價指標比較 與Sham 組相比，NT 組與MHT 組NDS 評分升高，NSE 和S100B 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與NT 組相比，MHT 組NDS 評分降低，NSE 和S100B 蛋白表達水平下降（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of nerve function indexes between the three groups表2 各組神經功能評價指標比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of nerve function indexes between the three groups表2 各組神經功能評價指標比較（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與NT組比較，P＜0.05。

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2.3 各組免疫功能指標對比 Sham 組、NT 組和MHT 組IgM、IgA、IgG 及T 細胞亞群CD4、CD8、CD4/CD8水平差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of immune function indexes between the three groups表3 各組免疫功能評價指標比較 （n=6，）

Tab.3 Comparison of immune function indexes between the three groups表3 各組免疫功能評價指標比較 （n=6，）

均P＞0.05。

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3 討論

3.1 TTM 可使心肺復蘇后患者獲得更好的神經功能預后 CA是全球重大公共衛生問題，并隨著新型冠狀病毒肺炎大流行愈發突出［5］。2020年國際復蘇聯絡委員會對全球16 個OHCA 中心的數據分析顯示，接受復蘇的患者30 d 存活率為3.1%～20.4%，僅2.8%～18.2%有良好的神經功能預后［6］。有文獻報道，我國北京、上海等城市的OHCA患者出院時神經功能良好的患者比例更低［7］。因此提高心肺復蘇成功率和改善復蘇后神經功能成為CA 患者預后的關鍵因素。Bartos 等［8］發現ECPR 患者死亡或神經功能不良的風險顯著降低，而且啟動越早獲益越大。2021 年歐洲復蘇委員會（ERC）指南推薦對于CA 出現自主循環恢復（ROSC）但未恢復意識的患者，應盡快將目標體溫控制在32～34 ℃［9］，且MHT 持續時間至少24 h，復溫速度應由TTM 設備進行控制（0.25～0.50 ℃/h），可獲得更好的長期神經功能［10］。

3.2 MHT 可改善CA 復蘇后神經功能 CA 復蘇后腦損傷是由神經系統突發缺血和復蘇后再灌注引起，這些損傷可能在CA 初期、復蘇過程中和復蘇后依次發生，而TTM 對腦損傷有明確的神經保護作用［11］。目前國內外學者將NSE和S100B蛋白作為評價CA 患者復蘇后腦損傷的特異性標志物［12］。本研究發現與Sham 組相比，NT 組與MHT 組NSE 和S100B蛋白表達水平顯著升高，表明動物CA復蘇后腦部出現顯著缺血再灌注損傷；MHT 組與NT 組相比NSE 和S100B蛋白表達水平下降，表明MHT 可顯著減輕CA 復蘇后腦損傷。Cui 等［13］證實TTM 可顯著改善CA 豬的神經功能，其可能機制為MHT 可抑制大腦小膠質細胞的激活與極化，減輕小膠質細胞合成及分泌炎性因子，發揮神經保護作用。本課題組前期研究發現MHT 可有效降低豬CA 經ECPR 后炎性因子的表達水平［14］。本研究同時對比各組NDS評分，結果顯示MHT 組與NT 組評分顯著高于Sham組，而MHT組NDS評分顯著低于NT組，進一步表明MHT可減輕CA后腦損傷，并顯著改善CA復蘇后的神經功能。需要指出的是，本研究采用的神經功能指標只能評估神經功能的部分水平，并不能反映全部神經功能的狀態，因此全面評估MHT 對CA 復蘇后神經功能的影響仍需更加深入的研究。

3.3 MHT對CA復蘇后免疫功能無顯著影響 目前關于MHT對CA復蘇后免疫功能影響的研究尚不明確。陳富明等［15］研究發現MHT 可改善心肺復蘇成功患者的肺功能，且對免疫功能無影響。本研究中，各組IgM、IgA、IgG及T細胞亞群CD4、CD8、CD4/CD8水平無明顯差異，這一結果與陳富明等發現相一致，表明早期給予一定時間MHT及正確復溫處理對CA經ECPR 后免疫功能無明顯影響。值得提出的是，CD4 和CD8 并不能反映全部免疫功能狀態，因此不同溫度、不同時間窗及治療時長可能對機體免疫功能產生不同的影響，這一領域仍需繼續深入研究。

綜上所述，MHT可改善豬心臟驟停體外心肺復蘇后神經功能，降低腦損傷標志物NSE 和S100B 蛋白表達，且對免疫功能無顯著影響，本研究可為臨床MHT提供一定的理論依據。