含笑內酯通過抑制NF-κB/NLRP3軸改善單側輸尿管梗阻模型小鼠的腎臟病變

雷向宏，嚴文君，熊梅梅，龍海波，陳斯佳

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）嚴重危害人類健康，發展至終末期可出現多種嚴重并發癥，是死亡的主要原因。2016 年，慢性腎臟病在全球死亡原因中排名第16位，預計到2040年將上升到第5位［1］。隨著人口老齡化及飲食結構的改變，糖尿病、高血壓患病人群日益增加，自1990年以來，全球CKD 的全年齡患病率增加了29.3%，2017 年全球CKD患者人數達6.975億，全球患病率9.1%；中國患病人數達1.323 億，因此CKD 防治已成為全世界共同關注的公共衛生問題［2］。由于CKD尚無有效的根治方法，對其發病機制及干預靶點的研究成為當前熱點。CKD 的一個重要特征是持續的腎臟炎癥狀態，并漸進性發展至腎纖維化。已知核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體能夠調節腎臟炎癥及腎纖維化［3］。含笑內酯（micheliolide，MCL）是以小白菊內酯為原料加工合成的具有抗炎及抗腫瘤作用的愈創木倍半萜內酯類化合物。筆者前期研究發現MCL 可抑制脂多糖誘導的腎小管上皮細胞核因子（NF）-κB 通路和NLRP3 炎癥小體通路的活化，從而改善腎小管細胞炎癥［4］。本研究以單側輸尿管梗阻（UUO）小鼠為研究對象，研究MCL對UUO 小鼠腎組織NLRP3 炎癥小體活化和相關炎性因子及腎臟病理損傷的影響，探討其抗腎纖維化機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 級7 周齡雄性C57BL/6J 小鼠購自湖南斯萊克景達有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，體質量20～25 g，普通飼料飼養，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。

1.2 主要試劑 MCL 衍生物二甲胺基含笑內酯富馬酸鹽（dimethylaminomicheliolide，DMAMCL）購自天津尚德緣藥業科技股份有限公司。DMAMCL 溶液配制：稱取DMAMCL 粉末8.0 mg溶解于3.2 mL生理鹽水，終濃度2.5 g/L。BCA蛋白定量試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，預染蛋白Marker 購自美國Thermo 公司，PVDF 膜購自美國Millipore 公司；兔源一抗NLRP3、胱天蛋白酶（caspase）-1、白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和磷酸化的NFκB p65（p-NF-κB p65）等抗體均購自美國Affinity公司，兔源一抗NF-κB p65 購自美國Proteintech 公司；鼠源一抗GAPDH、β-actin、山羊抗鼠IgG（H+L）和山羊抗兔IgG（H+L）購自中杉金橋生物技術有限公司；HE 染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Masson三色染色液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；TUNEL檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；超高靈敏度化學發光成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備 小鼠適應性飼養7 d 后，采用隨機數字表法分為假手術（Sham）組、UUO 組、UUO+MCL（給藥）組，每組6 只。Sham 組將小鼠左側輸尿管暴露游離，但不結扎；UUO 組和UUO+MCL 組將小鼠左側輸尿管暴露游離，用5-0絲線對左側輸尿管上端進行雙結扎；分層縫合好腹部切口，碘伏消毒。術后腹腔內注射10 萬U 青霉素。UUO+MCL 組小鼠造模前1 d起予以藥物干預，25 mg/kg MCL 每日灌胃0.5 mL，連續8 d。Sham 組給予等體積生理鹽水灌胃。術后7 d終止實驗，末次給藥24 h 后腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，用4 ℃預冷的PBS經心臟灌注小鼠全身各臟器，待腎臟顏色變白后，用剪刀迅速摘取腎臟。部分腎組織置于凍存管中迅速放入-80 ℃冰箱中保存用于提取蛋白，留取部分腎組織固定于4%多聚甲醛24 h，常規脫水，石蠟包埋，切片。實驗流程見圖1。

Fig.1 Schematic diagram of animal experiment design圖1 動物實驗設計示意圖

1.3.2 HE染色觀察小鼠腎組織病理變化 小鼠腎組織塊固定于4%多聚甲醛24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切成4 μm切片，放入載玻片上。將腎組織切片，脫蠟水化，HE染色，脫水透明，風干后中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 Masson 染色觀察小鼠腎組織腎纖維化情況 石蠟切片脫蠟，經核染液染色，1%鹽酸乙醇分化；麗春紅染色；1%磷鉬酸溶液分化；2.5%苯胺藍溶液復染；1%冰醋酸分化后，脫水晾干，封片后置于顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J軟件圖像分析計算膠原容積分數（CVF），即膠原陽性的面積與組織總面積的百分比，膠原纖維顯示為藍色。

1.3.4 TUNEL檢測細胞凋亡 腎組織切片于二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化，將切片置入濕盒。滴加胃蛋白酶，37 ℃反應30 min。PBS洗滌后滴加足量TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育2 h，洗滌后滴加DAPI 染核。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，陽性細胞核為紅色，使用Image J軟件計算各視野下陽性細胞數，計算其細胞凋亡率。

1.3.5 免疫組化染色檢測NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達 石蠟切片烤片、脫蠟水化后置于修復盒中。加入抗原修復液檸檬酸緩沖液，高壓鍋內加熱抗原修復。經3%H2O2消除內源性過氧化物酶，5%BSA 滴于載玻片上封閉非特異性蛋白后，滴加足量的稀釋好的一抗NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α、NF-κB p65，置于濕盒中4 ℃孵育過夜。次日漂洗孵育二抗后，PBS淋洗，DAB顯色，蘇木精復染，自來水沖洗，最后封片、鏡檢。陽性反應組織呈棕色，使用Image J軟件分析計算各視野的平均光密度值。

1.3.6 Western blot 檢測NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α、p-NF-κB p65 蛋白表達 稱取適量腎組織樣本，加入裂解液，放入組織研磨儀內研磨后，離心取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度并配平。95 ℃煮沸5 min 使蛋白變性。配制SDSPAGE 膠，電泳分離蛋白后轉移至PVDF 膜；用5%脫脂奶粉封閉2 h，NLRP3（1∶500）、caspase-1（1∶500）、IL-1β（1∶500）、TNF-α（1∶500）、p-NF-κB p65（1∶500）、GAPDH（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000）一抗4 ℃冰箱孵育過夜；用TBST洗膜3次，PVDF膜孵育二抗2 h后，TBST洗膜3次，用發光液浸濕PVDF膜后顯影成像。使用Image J 軟件計算條帶與內參的灰度比值。

1.4 統計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行數據分析。數據均采用均數±標準差（xˉ±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗或Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE 染色結果 Sham 組小鼠腎組織無明顯病變，未見腎小管擴張、間質炎癥細胞浸潤及纖維組織增生性改變。UUO 組腎小管進行性擴張，間質水腫伴有少量的炎性細胞浸潤。UUO+MCL 組腎組織病變程度較UUO組明顯好轉。見圖2。

Fig.2 HE staining Results of renal tissue in each group(×400)圖2 各組腎組織HE染色結果（×400）

2.2 Masson 染色結果 Sham 組、UUO 組、UUO+MCL 組CVF（%）分別為2.613±1.358、8.335±2.388 和1.958±0.784（n=6，F=27.133，P＜0.01），與Sham 組相比，UUO 組膠原容積分數增加（P＜0.05），腎小管擴張，腎間質寬度增加。UUO+MCL 組膠原容積分數較UUO組減少（P＜0.05）。見圖3。

Fig.3 Masson staining Results of kidney tissue in each group(×400)圖3 各組腎組織Masson染色結果（×400）

2.3 TUNEL 染色結果 Sham 組、UUO 組、UUO+MCL 組的細胞凋亡率（%）分別為1.056±0.929、11.037±2.736 和3.611±2.284（n=6，F=35.675，P＜0.01），與Sham組相比，UUO組小鼠腎組織細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。與UUO 組相比，UUO+MCL組凋亡率明顯下降（P＜0.01）。見圖4。

Fig.4 TUNEL staining Results of kidney tissue in each group(×400)圖4 各組腎組織TUNEL染色結果（×400）

2.4 免疫組化染色結果 與Sham 組相比，UUO 組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表達水平升高（P＜0.05）；UUO+MCL 組與UUO 組相比，NLRP3、caspase-1、IL-1β 和TNF-ɑ 表達水平下降（P＜0.05）。見圖5、表1。

Tab.1 Comparison of the expression levels of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-α proteins in renal tissue between the three groups表1 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α蛋白表達水平比較（n=6，xˉ±s）

Fig.5 Immunohistochemical Results of of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-ɑ in renal tissue(×400)圖5 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α免疫組化結果（×400）

2.5 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α蛋白印跡結果 與Sham 組相比，UUO 組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α的表達水平均升高（P＜0.05）；UUO+MCL 組較UUO 組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α均下降（P＜0.05）。見圖6、表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-α proteins in renal tissue between the three groups表2 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α蛋白表達水平比較（n=6，xˉ±s）

Fig.6 The expression levels of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-α proteins in renal tissue of each group detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α蛋白表達情況

2.6 各組腎組織NF-κB p65 的免疫組化染色和p-NF-κB p65蛋白免疫印跡結果 Sham組、UUO 組和UUO+MCL 組NF-κB p65 蛋白表達水平分別為0.043±0.007、0.162±0.012 和0.061±0.008（n=6，F=283.885，P＜0.01），與Sham 組相比，UUO 組NF-κB p65 蛋白表達量上升（P＜0.05）。與UUO 組相比，UUO+MCL 組NF-κB p65 蛋白表達量下降（P＜0.05）。見圖7。蛋白免疫印跡結果顯示，Sham 組、UUO組和UUO+MCL組p-NF-κB p65蛋白表達水平分別為0.342±0.072、0.454±0.056 和0.336±0.065（n=6，F=6.281，P＜0.05），與Sham 組相比，UUO 組p-NF-κB p65 蛋白表達量上升（P＜0.05）。與UUO 組相比，UUO+MCL 組p-NF-κB p65 蛋白表達量下降（P＜0.05）。見圖8。

Fig.7 Immunohistochemical Results of NF-κB p65 in renal tissue(×400)圖7 各組腎組織NF-κB p65免疫組化結果（×400）

3 討論

腎間質炎癥和腎纖維化是終末期腎病病程進展的重要病變［5］。上皮-間充質轉化（EMT）參與了腎纖維化形成的過程，上皮細胞在慢性或反復損傷的情況下分化為肌成纖維細胞，形成纖維化的疤痕組織［6］。炎性細胞或腎駐留細胞分泌的促炎和促纖維化因子，如IL-1、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1和轉化生長因子（TGF）-β，參與了CKD 的發生和進展。腎小管間質炎癥是腎纖維化形成的關鍵過程。腎臟損傷后，各種促炎刺激可以激活成纖維細胞［7］。

3.1 腎臟炎癥在腎纖維化發展中的作用 本實驗UUO 動物模型是以腎小管損傷為主要特征的腎間質纖維化模型。輸尿管梗阻導致腎間質炎癥和纖維化反應，慢性腎小管間質性腎炎是CKD特別是梗阻性尿路疾病的主要病理改變［8］。通過調控相關因子抑制腎小管炎癥可減輕腎纖維化的嚴重程度［9-10］。本研究HE 染色及Masson 染色結果表明MCL 減輕UUO小鼠的腎間質炎癥及腎纖維化，TUNEL染色結果表明MCL下調了UUO小鼠的腎組織的細胞凋亡。炎癥小體是細胞內的傳感器，可通過損傷相關的分子模式與細胞表面Toll樣受體家族的連接而被激活，導致炎癥反應。這個過程激活NF-κB信號通路或線粒體活性氧的產生并觸發炎癥小體［11］。NLRP3 炎癥小體能夠調節腎臟炎癥及腎纖維化［12］。其可被多種非微生物危險信號激活。NLRP3通過富含亮氨酸的重復序列和含熱蛋白結構域招募凋亡相關斑點樣蛋白（ASC），然后ASC水解pro-caspase-1。最后，活化的caspase-1 將IL-1β 和IL-18 切割成成熟形式［13］。IL-1β 和IL-18 是參與CKD 進展的重要促炎細胞因子。Vilaysane等［12］研究發現，在UUO小鼠模型中，NLRP3 基因敲除（NLRP3-/-）小鼠較野生型小鼠caspase-1、IL-1β 和IL-18 表達顯著降低，腎小管損傷，炎癥和纖維化明顯減少。

3.2 MCL 對腎臟炎癥及腎纖維化的作用機制探討 MCL是以NF-κB抑制劑小白菊內酯（PTL）體外半合成的倍半萜烯內酯化合物。小白菊內酯是從艾菊、觀光木等藥用植物中提取而來。MCL 較PTL 具有更高的穩定性，更低的毒性和更長的半衰期［14］。本研究使用的DMAMCL 在生理或中性條件下表現出更高的穩定性、更低的毒性以及MCL釋放的持續性。現已證明MCL具有強大的抗炎和抗癌作用［15］，具有廣闊的臨床應用前景。MCL能通過上調腹膜間皮細胞的自噬水平有效抑制腹膜纖維化［16］。MCL能通過抑制糖尿病小鼠Mtdh 介導的腎臟炎癥水平改善糖尿病性腎臟疾病腎損傷［17］。筆者前期研究發現MCL可通過抑制線粒體ROS的釋放，進一步抑制NF-κB通路及NLRP3炎癥小體的活化，改善腎小管細胞炎癥［4］。

本研究發現，MCL可減輕UUO小鼠腎組織間質炎癥反應及腎纖維化，并減少腎組織細胞凋亡；免疫組化染色及免疫印跡結果顯示，MCL 干預后NLRP3、caspase-1、IL-1β 較UUO 組顯著下調，表明MCL抑制UUO小鼠腎組織NLRP3炎癥小體的活化，改善了腎間質炎癥反應。已知細胞焦亡是一種炎性細胞死亡方式，主要標志是炎癥小體的形成、caspase的激活以及大量促炎因子的釋放。因此，筆者認為MCL可抑制UUO小鼠腎組織的細胞焦亡。

促炎轉錄因子NF-κB 調節先天和適應性免疫反應的多個方面。在炎癥小體中，NF-κB 可誘導NLRP3和IL-1β在炎癥信號應答中轉錄調控［11］。靜息狀態下NF-κB的異源二聚體（p65-p50）和抑制蛋白IκB 結合，以無活性的形式存在于細胞質中，當NF-κB 被IL-1、IL-2、TNF-α 等細胞因子刺激后，導致NF-κB p65磷酸化并進入細胞核內。本研究發現MCL 下調UUO 小鼠腎組織p-NF-κB p65 蛋白的表達，表明MCL 可通過抑制NF-κB 通路抑制UUO 小鼠腎組織間質炎癥，在NLRP3炎癥小體活化的過程中，NF-κB 活化介導了NLRP3 啟動過程，因此推測MCL 通過抑制NF-κB/NLRP3 軸減輕UUO 小鼠腎間質炎癥及纖維化。

綜上所述，本研究發現MCL通過下調UUO小鼠腎組織p-NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α表達減輕腎間質炎癥及腎纖維化，表明MCL可能通過抑制NF-κB/NLRP3軸實現腎臟保護作用。這對今后MCL 在腎纖維化的防治中提供了理論依據，但本研究樣本數目較少，且只選擇了術后一個時間點進行研究，故結果具有一定局限性。今后將擴大樣本深入研究MCL抗腎纖維化機制。