CircACTR2調(diào)節(jié)miR-23a-3p/TBL1X軸對(duì)高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷的影響

黃春艷，向汨，費(fèi)志醫(yī)，高琴

妊娠糖尿病是女性妊娠過(guò)程中發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常疾病，高齡、肥胖是其主要致病因素［1］。妊娠糖尿病易導(dǎo)致胎兒畸形、早產(chǎn)、流產(chǎn)等，增加妊娠女性發(fā)生2 型糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)［2］。滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎早期著床、排除代謝物和母胎物質(zhì)交換等方面發(fā)揮重要作用，其異常易引起早產(chǎn)、流產(chǎn)等［3］。因此，深入探究滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷機(jī)制對(duì)治療妊娠糖尿病有重要意義。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）對(duì)包括妊娠期糖尿病在內(nèi)的多種代謝類(lèi)疾病的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)進(jìn)程具有調(diào)控作用［4］。有研究表明，環(huán)狀RNA 肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2（circular RNA actin related protein 2，circACTR2）在妊娠糖尿病患者中過(guò)表達(dá)［5］。circRNA 可充當(dāng)微小RNA（miRNA）的“海綿”來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miR-23a-3p在糖尿病患者中低表達(dá)，抑制miR-23a-3p 表達(dá)可抵消白藜蘆醇對(duì)妊娠糖尿病小鼠和脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和脂質(zhì)代謝的改善作用［6］。還有研究表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)素β1X 連鎖蛋白（TBL1X）的異常高表達(dá)與胎盤(pán)質(zhì)量增加顯著相關(guān)［7］。而circACTR2 通過(guò)調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸對(duì)高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞的影響尚不明確。因此，本研究主要探究circACTR2 對(duì)高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞的影響及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo 購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。CCK-8試劑盒（R2704）購(gòu)自北京康瑞納生物科技有限公司；丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；兔源一抗TBL1X、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、胱天蛋白酶3（caspase-3）以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；LipofectamineTM2000 Reagent 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；circACTR2 敲低質(zhì)粒（si-circACTR2）及對(duì)照（si-NC），miR-23a-3p 抑制劑（miR-23a-3p inhibitor）及對(duì)照（inhibitor-NC）、miR-23a-3p 模擬物（miR-23a-3p mimics）及對(duì)照（mimics-NC）、circACTR2 及miR-23a-3p 引物購(gòu)自廣州RiboBio公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HTR-8/Svneo 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的穩(wěn)定環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，定期觀(guān)察，每2 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，消化傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR-8/Svneo 細(xì)胞分為NG 組（5.5 mmol/L 葡萄糖處理）、HG 組［8］（25 mmol/L 葡萄糖處理）、si-NC 組（25 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染si-NC）、sicircACTR2 組（25 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染si-circACTR2）、sicircACTR2+inhibitor-NC 組（25 mmol/L 葡萄糖+si-circACTR2和inhibitor-NC 共轉(zhuǎn)染）、si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor組（25 mmol/L 葡萄糖+si-circACTR2 和miR-23a-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine?2000 Transfection Reagent操作步驟進(jìn)行。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)circACTR2、miR-23a-3p表達(dá) 使用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：circACTR2 上游5'-TGTGCTTTCTGGAGGTACT-3'，下游5'-TGCCTCATCACCAACCATA-3' ；miR-23a-3p 上 游 5'-CAGTCTTGTCCAGTTTTC-3' ，下游5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTG-3' ；GAPDH 上游5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，下游5'-AAGTGGTCGTGTGTGAGGAGCAATG-3'；U6 上游5'-AACGCTTCACGAATTGCGT-3'，下游5'-CTCGCTTCGGCACACA-3'。分別以GAPDH、U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中circACTR2、miR-23a-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種到96孔板中。分別將細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去細(xì)胞上清液，向每個(gè)孔中加入含有10 μL CCK-8溶液的100 μL完全培養(yǎng)基。孵育2 h 后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處光密度（OD）值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組HTR-8/Svneo細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，添加100 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，再分別添加Annexin V-FITC 和PI 染液5 μL，充分混勻，于室溫下避光染色15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取各組細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，采用20 μL 移液器槍頭進(jìn)行劃痕，顯微鏡下記0 h 時(shí)細(xì)胞的劃痕寬度為W0，記24 h 時(shí)細(xì)胞的劃痕寬度為W24。劃痕愈合率（%）=（W0-W24）/W0×100%。

1.2.7 MDA 水平以及LDH、SOD 活性檢測(cè) 取各組HTR-8/Svneo細(xì)胞，加入提取液，超聲破碎細(xì)胞，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)MDA含量和LDH、SOD活性。

1.2.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 利用RIPA裂解緩沖液冰上裂解30 min提取HTR-8/Svneo 細(xì)胞總蛋白。BCA 法定量，蛋白樣品變性后每孔50 μg加載到10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，100 V 恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，將膜與一抗TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過(guò)夜，再將膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h，棄去液體，洗滌3 次，加入ECL 試劑觀(guān)察蛋白質(zhì)印跡，Image J 軟件評(píng)估蛋白的灰度值。通過(guò)目的蛋白與GAPDH 的灰度值比，得出其蛋白相對(duì)表達(dá)量，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.2.9 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別構(gòu)建circACTR2野生型質(zhì)粒（circACTR2-WT）和突變型質(zhì)粒（circACTR2-MUT），TBL1X 野生型質(zhì)粒（TBL1X-WT）和突變型質(zhì)粒（TBL1XMUT），將其分別與mimics-NC 或miR-23a-3p mimics 共轉(zhuǎn)染于HTR-8/Svneo細(xì)胞，48 h后檢測(cè)螢光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Graphpad Prism 7.0 軟件用于數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞中circACTR2、miR-23a-3p 表達(dá)比較 與NG 組相比，HG 組HTR-8/Svneo細(xì)胞中circACTR2表達(dá)升高，miR-23a-3p表達(dá)降低（P＜0.05）；與HG 組、si-NC 組相比，sicircACTR2組細(xì)胞中circACTR2表達(dá)降低，miR-23a-3p 表達(dá)升高（P＜0.05）；與si-circACTR2 組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組細(xì)胞中circACTR2 表達(dá)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-23a-3p 表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of expression of circACTR2 and miR-23a-3p in HTR-8/Svneo cells between the six groups表1 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中circACTR2、miR-23a-3p表達(dá)比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與NG 組比較，b與HG 組比較，c與si-NC 組比較，d與si-circACTR2 組比較，e 與si-circACTR2+inhibitor-NC 組比較，P＜0.05；表2—4同。

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2.2 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖能力比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，與NG組相比，HG組HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值降低（P＜0.05）；與HG 組、si-NC 組相比，si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞OD450值升高（P＜0.05）；與si-circACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞OD450值降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of proliferative ability of HTR-8/Svneo cells between the six groups表2 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖能力比較（n=6，OD450值，）

Tab.2 Comparison of proliferative ability of HTR-8/Svneo cells between the six groups表2 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖能力比較（n=6，OD450值，）

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2.3 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞凋亡情況比較 與NG組相比，HG 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與HG 組、si-NC 組相比，si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與sicircACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Comparison of HTR-8/Svneo cell apoptosis and apoptosis rate between the six groups圖1 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡情況及凋亡率比較

2.4 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞遷移能力比較 與NG組相比，HG 組細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與HG組、si-NC組相比，si-circACTR2組細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與 si-circACTR2 組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circNFATC3+miR-183-5p inhibitor 組細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Fig.2 Comparison of HTR-8/Svneo cell migration and scratch healing rate between the six groups圖2 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移情況及其劃痕愈合率比較

2.5 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞MDA 水平以及LDH、SOD 活性比較 與NG 組相比，HG 組HTR-8/Svneo細(xì)胞中MDA 水平升高，LDH 活性增強(qiáng)，SOD 活性減弱（P＜0.05）；與HG組、si-NC 組相比，si-circACTR2組HTR-8/Svneo 細(xì)胞MDA 水平降低，LDH 活性減弱，SOD活性增強(qiáng)（P＜0.05）；與si-circACTR2組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circNFATC3+miR-183-5p inhibitor組細(xì)胞MDA水平升高，LDH活性增強(qiáng)，SOD活性減弱（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3 Comparison of MDA level,LDH,SOD activities of HTR-8/Svneo cells between the six groups表3 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞MDA水平以及LDH、SOD活性比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of MDA level,LDH,SOD activities of HTR-8/Svneo cells between the six groups表3 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞MDA水平以及LDH、SOD活性比較（n=6，）

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2.6 各組TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較 與NG 組相比，HG 組HTR-8/Svneo細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低，TBL1X、caspase-3表達(dá)升高（P＜0.05）；與HG組、si-NC 組相比，si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)升高，TBL1X、caspase-3 表達(dá)降低（P＜0.05）；與si-circACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低，TBL1X、caspase-3表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表4。

Fig.3 Western blot detection of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 protein expression in HTR-8/Svneo cells圖3 Western blot檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)

Tab.4 Comparison of protein expression of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 in HTR-8/Svneo cells between the six groups表4 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)比較 （n=6，）

Tab.4 Comparison of protein expression of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 in HTR-8/Svneo cells between the six groups表4 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)比較 （n=6，）

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2.7 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果 Starbase 網(wǎng)站預(yù)測(cè)circACTR2與miR-23a-3p的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖4A，miR-23a-3p 與TBL1X 的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖5A。在circACTR2-WT 中，與轉(zhuǎn)染mimics-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-23a-3p mimics 后細(xì)胞螢光素酶活性降低（P＜0.05），在circACTR2-MUT的細(xì)胞中螢光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4B。與轉(zhuǎn)染mimics-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-23a-3p mimics 后，同時(shí)轉(zhuǎn)染TBL1X-WT 的細(xì)胞螢光素酶活性降低（P＜0.05），而同時(shí)轉(zhuǎn)染TBL1X-MUT 的細(xì)胞螢光素酶活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5B。

Fig.4 Binding sites of circACTR2 to miR-23a-3p and Results of dualluciferase assay圖4 circACTR2與miR-23a-3p的結(jié)合位點(diǎn)及雙螢光素酶檢測(cè)結(jié)果

Fig.5 Binding sites of miR-23a-3p to TBL1X and Results of dualluciferase assay圖5 miR-23a-3p與TBL1X的結(jié)合位點(diǎn)及雙螢光素酶檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 高糖可誘導(dǎo)HTR-8/Svneo 細(xì)胞損傷 妊娠糖尿病是妊娠期發(fā)生的一種嚴(yán)重危害母嬰健康的疾病［9］。妊娠糖尿病發(fā)生的主要原因是糖代謝異常，高糖處理能使滋養(yǎng)層細(xì)胞的微絨毛排列紊亂，出現(xiàn)疏密不均等現(xiàn)象，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞增殖和遷移［10］。本研究用25 mmol/L 葡萄糖處理HTR-8/Svneo 細(xì)胞，結(jié)果表明細(xì)胞增殖和遷移能力、SOD 活性減弱，MDA 含量升高，LDH 活性、凋亡能力增強(qiáng)。

3.2 敲低circACTR2 可抑制高糖誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo 細(xì)胞損傷 circRNA 是一類(lèi)具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、表達(dá)豐富、內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)等特點(diǎn)的非編碼RNA，其可參與到妊娠糖尿病的多種生物學(xué)過(guò)程中［11］。有研究表明，circ_0008285 在妊娠糖尿病患者中表達(dá)顯著上調(diào)，敲低circ_0008285 促進(jìn)了高糖誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［12］。而在妊娠糖尿病患者的胎盤(pán)和血漿中circ_0005243 表達(dá)顯著降低，敲低circ_0005243可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移能力［13］。circACTR2 在高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡［14］，而孕婦血漿中circACTR2 水平升高可預(yù)測(cè)妊娠糖尿病，妊娠糖尿病患者血漿circACTR2 水平升高可預(yù)測(cè)宮內(nèi)死亡、胎兒畸形等多種不良事件［5］。本研究結(jié)果顯示，敲低circACTR2 可使HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖能力、PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)、SOD 活性升高，circACTR2 和caxpase-3 表達(dá)、凋亡率、MDA 含量、LDH 活性明顯降低，提示敲低circACTR2 可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖和遷移能力，抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

3.3 敲低circACTR2 可通過(guò)靶向miR-23a-3p 抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞損傷 miRNA在妊娠糖尿病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［15］。與健康妊娠者相比，妊娠糖尿病患者血清中的miR-195-5p 表達(dá)顯著增加，miR-195-5p 可作為妊娠糖尿病的診斷生物標(biāo)志物［16］。circRNA 可靶向miRNA 對(duì)妊娠糖尿病起調(diào)控作用，如circ-PNPT1 可通過(guò)直接吸附miR-889-3p 調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞功能障礙［17］。本研究結(jié)果顯示，敲低circACTR2 可靶向上調(diào)miR-23a-3p 表達(dá)，且抑制miR-23a-3p減弱了敲低circACTR2對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖和遷移能力的促進(jìn)作用，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。故提示敲低circACTR2可能通過(guò)上調(diào)miR-23a-3p 促進(jìn)HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

3.4 敲低circACTR2 可通過(guò)調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞損傷 miRNA可通過(guò)靶向抑制其特定mRNA翻譯或促進(jìn)降解來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等多種生物學(xué)過(guò)程。有研究表明，miR-345-3p 通過(guò)靶向BAK1抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移［18］。本研究表明，miR-23a-3p 可靶向負(fù)調(diào)控TBL1X 表達(dá)，下調(diào)miR-23a-3p 減弱了敲低circACTR2 對(duì)TBL1X蛋白表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，敲低circACTR2 可通過(guò)調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸，進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮保護(hù)作用。circACTR2/miR-23a-3p/TBL1X 軸可能成為治療妊娠糖尿病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。然而本研究尚存在不足之處，僅在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了circACTR2/miR-23a-3p/TBL1X 軸對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和氧化應(yīng)激的影響，后續(xù)研究將會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步探索。