miR-338-5p通過靶向TSHZ3促進膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲

劉宏偉，朱奕，向玲寶，熊洪，陳瑞琦

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，具有較高的病死率和復發率。然而，膀胱癌缺乏可靠的腫瘤標志物，并且其進展的分子機制尚未完全闡明。目前已發現大量miRNA在膀胱癌中表達失調，影響腫瘤增殖、侵襲、血管生成等過程，其有成為膀胱癌早期診斷標志物的巨大潛力［1］。研究表明，miR-338-5p 在人類多種癌癥中表達失調［2-4］。然而，miR-338-5p 在膀胱癌中的作用和機制尚未闡明。本研究通過檢測miR-338-5p在膀胱癌中的表達，并通過細胞實驗闡明miR-338-5p在膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1 和人膀胱癌細胞T24 和UM-UC-3 均購自中國科學院上海細胞庫。miR-338-5p mimics和miR-338-5p inhibitor購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；TSHZ3過表達質粒（以GV712為載體）購自上海吉凱基因有限公司；F-12K、RPMI-1640 和DMEM 培養基購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術有限公司；Lipofectamine RNAimax 轉染試劑和Trizol 試劑購自美國Invitrogon公司；X-tremeGENE HP DNA轉染試劑購自Roche公司；CCK-8試劑購自日本同仁公司；Transwell小室購自美國BD 公司；PrimeScript 反轉錄試劑盒和TB Green premix Ex Taq 試劑盒購自TaKaRa 公司；miRNA 熒光定量PCR試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司；SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TSHZ3、Wnt3a、β-catenin、GAPDH 和β-actin抗體購自美國proteintech公司。

1.2 組織標本 收集2019 年9 月—2022 年9 月在廣東醫科大學附屬醫院行根治性膀胱切除術的33例膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織。組織標本取出后立即置于液氮中保存，所有癌組織均經病理醫師診斷為膀胱尿路上皮癌。患者均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養和轉染 SV-HUC-1 細胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的F-12K培養基中培養，T24細胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養基中培養，UM-UC-3細胞在DMEM培養基中培養，放置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養箱內。轉染時，提前將2×105個T24 細胞或1.5×105個UM-UC-3 細胞接種至6 孔板內，按照轉染試劑說明書將miR-338-5p mimics、miR-338-5p inhibitor、TSHZ3 過表達質粒和各自的對照組（mimics-NC、inhibitor-NC、vector）分別轉染至T24和UM-UC-3細胞中，于培養箱內培養6 h后更換為完全培養基繼續培養。

1.3.2 RNA 提取和qRT-PCR 將SV-HUC-1、T24 和UMUC-3細胞接種至6孔板內，待細胞處于對數生長期提取各細胞系的RNA。T24 和UM-UC-3 細胞轉染24 h 后，收集各組細胞，提取RNA。分別將膀胱癌組織和癌旁組織研磨，提取RNA。將以上提取的RNA測定濃度，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA 反轉錄為cDNA，miRNA 的反轉錄采用加尾法。miR-338-5p 引物：上游5'-ACGGTACTAACAATATCCTGG-3'，下游引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。內參采用U6，U6引物：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH 引物：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 個循環。結果采用2-ΔΔCt計算各基因相對表達量。

1.3.3 CCK-8 實驗 將轉染后處于對數生長期的T24 和UM-UC-3 細胞分別接種至96 孔板內，每孔1 000 個細胞，每組設置4個復孔。分別在第1、2、3、4、5天同一時間向每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續在培養箱內孵育2 h。在酶標儀450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并繪制細胞增殖曲線。

1.3.4 Transwell 遷移實驗 收集轉染24 h 后處于對數生長期的各組細胞，離心后用無血清培養基將細胞沉淀重懸為單個細胞并計數。在24孔板下室加入600 μL血清含量為20%的完全培養基，將Transwell 小室置于24孔內，在小室內加入200 μL 含8×104個細胞的重懸液，置于培養箱內繼續培養18 h 后取出，采用4%多聚甲醛固定、結晶紫染色，待小室干燥后在顯微鏡下隨機讀取3個視野拍照并計數。

1.3.5 Transwell侵襲實驗 提前將凍存于-20 ℃的基質膠置于4 ℃解凍。次日，按照基質膠和無血清培養基1∶5 的體積比配成稀釋液，Transwell 小室置于24 孔板內，吸取50 μL 的基質膠稀釋液鋪于小室內，然后將24 孔板置于37 ℃培養箱內2～3 h使基質膠稀釋液凝固，后續實驗步驟同Transwell遷移實驗。

1.3.6 雙螢光素酶報告基因實驗 采用TargetScan、miRDB和Targetminer 數據庫預測miR-338-5p 潛在的靶基因，選定靶基因TSHZ3。構建miR-338-5p與TSHZ3的雙螢光素酶報告基因載體，將含有與miR-338-5p結合位點的TSHZ3 3'-非翻譯區（UTR）的野生型序列和突變型序列分別插入GPmiRGLO質粒中，構建TSHZ3野生型質粒（TSHZ3-wt）和突變型質粒（TSHZ3-mut）。然后將2 種質粒分別與miR-338-5p mimics共轉染至膀胱癌細胞中。24 h后收集細胞，按照說明書操作要求，使用帶有化學發光檢測的酶標儀檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的發光信號強度，根據測得值進行統計分析。

1.3.7 Western blot 實驗 收集轉染后48 h 的細胞并提取各組總蛋白，測量蛋白濃度并加熱變性。制備SDS-PAGE 凝膠，將30 μg總蛋白加入上樣孔內，恒壓電泳2 h，然后恒流轉膜2 h，將蛋白轉移至PVDF 膜。轉膜后脫脂奶粉封閉1 h。在4 ℃條件下孵育一抗（TSHZ3、Wnt3a 抗體濃度為1∶1 000，β-catenin、GAPDH 和β-actin 抗體濃度為1∶10 000）過夜，次日孵育二抗1 h并進行化學反應曝光，使用Image J 軟件進行灰度值分析。

1.4 統計學方法 上述實驗均重復3 次。實驗數據采用GraphPad Prism 8.0 作圖，SPSS 21.0 進行數據分析，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett 法；2 組間均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-338-5p 在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達 miR-338-5p 在膀胱癌組織中的表達量高于癌旁組織（2.99±1.65vs. 1.29±0.22，n=33，t=5.220，P＜0.01）。

2.2 miR-338-5p 在正常輸尿管上皮細胞和膀胱癌細胞中的表達 miR-338-5p 在膀胱癌T24 和UMUC-3 細胞中的表達高于其在輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1中的表達，見圖1。

Fig.1 The expression of miR-338-5p in normal urothelial cells and bladder cancer cells圖1 miR-338-5p在正常輸尿管上皮細胞和膀胱癌細胞中的表達

2.3 過表達和敲低miR-338-5p的轉染效率 膀胱癌T24 和UM-UC-3 細胞中miR-338-5p mimics 組miR-338-5p 的相對表達量是mimics-NC 組的（5.75±0.48）倍和（6.04±0.33）倍，見圖2A。而轉染miR-338-5p inhibitor 后，與inhibitor-NC 相比，miR-338-5p的表達水平下調，見圖2B。

Fig.2 Transfection efficiency of overexpression and inhibition of miR-338-5p圖2 過表達和敲低miR-338-5p的轉染效率

2.4 過表達和敲低miR-338-5p對膀胱癌細胞增殖的影響 CCK-8結果顯示，與mimics-NC組相比，過表達miR-338-5p后T24和UM-UC-3細胞的增殖能力提高；轉染miR-338-5p inhibitor 后細胞的增殖能力下降（P＜0.05）。見圖3、4。

Fig.3 Effect of overexpression of miR-338-5p on cell proliferation detected by CCK-8 assay圖3 CCK-8檢測過表達miR-338-5p對細胞增殖的影響

Fig.4 Effect of inhibition of miR-338-5p on cell proliferation detected by CCK-8 assay圖4 CCK-8檢測抑制miR-338-5p表達對細胞增殖的影響

2.5 過表達和敲低miR-338-5p對膀胱癌細胞遷移和侵襲的影響 Transwell 遷移和侵襲實驗結果顯示，miR-338-5p mimics組膀胱癌細胞的遷移和侵襲細胞數均高于mimics-NC 組；轉染miR-338-5p inhibitor 后膀胱癌細胞的遷移和侵襲細胞數較inhibitor-NC組減少（P＜0.05）。見表1，圖5、6。

Tab.1 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the four groups表1 各組遷移和侵襲細胞數比較（n=3，個/視野，）

Tab.1 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the four groups表1 各組遷移和侵襲細胞數比較（n=3，個/視野，）

＊＊P＜0.01。

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Fig.5 Effects of overexpression of miR-338-5p on migration and invasion of bladder cancer cells(crystal violet staining,×200)圖5 過表達miR-338-5p對膀胱癌細胞遷移和侵襲的影響（結晶紫染色，×200）

Fig.6 Effects of inhibition of miR-338-5p on migration and invasion of bladder cancer cells(crystal violet staining,×200)圖6 抑制miR-338-5p表達對膀胱癌細胞遷移和侵襲的影響（結晶紫染色，×200）

2.6 miR-338-5p 與TSHZ3 3'-UTR 的潛在結合位點 篩選出TSHZ3 可能為miR-338-5p 的潛在靶基因。TargetScan 預測miR-338-5p 與靶基因TSHZ3的3'-UTR的結合位點，見圖7。

Fig.7 Nucleotide sequences complementary to miR-338-5p in the 3'-UTR of TSHZ3圖7 TSHZ3的3'-UTR與miR-338-5p互補的核苷酸序列

2.7 miR-338-5p 對TSHZ3 的靶向調控作用 將構建的TSHZ3-wt 和TSHZ3-mut 分別與miR-338-5p mimics 共轉染T24 和UM-UC-3 細胞。雙螢光素酶報告基因結果顯示，miR-338-5p mimics能夠降低野生型TSHZ3質粒的螢光素酶活性（P＜0.05），然而不能降低突變型TSHZ3 質粒的螢光素酶活性（P＞0.05），見表2。過表達miR-338-5p可降低膀胱癌細胞中TSHZ3 mRNA和蛋白水平，見圖8、9。

Tab.2 Comparison of the luciferase activity between the two groups表2 各組螢光素酶活性比較 （n=3，）

Tab.2 Comparison of the luciferase activity between the two groups表2 各組螢光素酶活性比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01。

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Fig.8 Effect of overexpression of miR-338-5p on TSHZ3 mRNA expression圖8 過表達miR-338-5p對TSHZ3 mRNA表達的影響

Fig. 9 Effect of overexpression of miR-338-5p on TSHZ3 protein level圖9 過表達miR-338-5p對TSHZ3蛋白水平的影響

2.8 過表達TSHZ3 減弱miR-338-5p 的促癌作用 細胞實驗結果顯示，與SV-HUC-1 細胞相比，T24 和UM-UC-3 細胞TSHZ3 mRNA 表達水平也顯著降低（P＜0.05），見圖10。功能挽救實驗顯示，相較于mimics-NC組，過表達miR-338-5p能夠提高膀胱癌細胞的增殖能力，同時過表達TSHZ3 部分抵消了miR-338-5p 對膀胱癌細胞增殖的促進作用（P＜0.05），見圖11。同時轉染miR-338-5p mimics 和過表達TSHZ3 組細胞的遷移和侵襲能力較miR-338-5p mimics組明顯降低（P＜0.05），見表3、圖12。

Tab.3 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the three groups表3 各組遷移和侵襲細胞數比較（n=3，個/視野，）

Tab.3 Comparison of the number of migrated and invaded cells between the three groups表3 各組遷移和侵襲細胞數比較（n=3，個/視野，）

＊＊P＜0.01；a 與mimics-NC 組比較，b 與miR-338-5p mimics 組比較，P＜0.05。

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Fig.10 The mRNA expression of TSHZ3 in normal urothelial cells andbladder cancer cells圖10 TSHZ3 mRNA在正常輸尿管上皮細胞和膀胱癌細胞中的表達

Fig.11 Cell viability detected by CCK-8 assay in each group圖11 CCK-8檢測各組細胞增殖活力

Fig.12 Migration and invasion of each group of cells(crystal violet staining,×200)圖12 各組細胞遷移侵襲情況（結晶紫染色，×200）

2.9 過表達miR-338-5p對Wnt/β-catenin信號通路的影響 Western blot 結果表明，與mimics-NC 組相比，過表達miR-338-5p 增加膀胱癌UM-UC-3 細胞中Wnt3a（0.78±0.03vs.1.21±0.05，n=3，t=12.874，P＜0.01）和β-catenin（0.88±0.02vs. 1.25±0.06，n=3，t=10.979，P＜0.01）蛋白表達水平，見圖13。

Fig.13 Effect of overexpression of miR-338-5p on the protein level of Wnt3a and β-catenin圖13 過表達miR-338-5p對Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影響

2.10 過表達TSHZ3對Wnt/β-catenin信號通路的影響 在膀胱癌UM-UC-3 細胞中轉染TSHZ3 過表達質粒，Western blot結果顯示，與vector組相比，Wnt3a（0.82±0.05vs. 0.51±0.04，n=3，t=8.138，P＜0.01）和β-catenin（0.94±0.03vs.0.75±0.07，n=3，t=4.409，P＜0.05）蛋白水平降低，見圖14。

Fig.14 Effect of overexpression of TSHZ3 on the protein level of Wnt3a and β-catenin圖14 過表達TSHZ3對Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影響

3 討論

膀胱癌與高齡、吸煙、接觸化學致癌物、職業暴露和環境污染等多種因素相關，具有較高的復發率和進展率［5］。研究表明，癌基因的激活或者抑癌基因的失活與膀胱癌的發生及進展密切相關［6］。miRNA 是一種長度為20～22 個核苷酸的非編碼RNA，其表達失調與惡性腫瘤的增殖、遷移、侵襲、凋亡和轉移等生物學行為密切相關［7］。因此，闡明膀胱癌中關鍵miRNA的作用和機制，探索新的潛在診斷標志物和治療靶點具有重要的臨床意義。

3.1 miR-338-5p 在腫瘤中的表達及作用 研究表明，miR-338-5p在肺癌［2］、食管癌［8］和胃癌［9］中表達下調，在膠質瘤［3］、惡性黑色素瘤［10］、視網膜母細胞瘤［11］和結直腸癌［4］中表達上調。本研究首先檢測了miR-338-5p 在膀胱癌中的表達，qRT-PCR 結果顯示miR-338-5p 在膀胱癌中呈高表達。細胞功能實驗表明過表達miR-338-5p 可促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，敲低miR-338-5p 表達抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。TSHZ3 基因能夠編碼一種鋅指轉錄因子，課題組前期研究證實TSHZ3 在膀胱癌中低表達并抑制細胞的增殖、遷移與侵襲［12］。通過生物信息學預測發現miR-338-5p 與TSHZ3 的3'-UTR 存在潛在結合位點。雙螢光素酶報告基因實驗顯示，在膀胱癌細胞中，與mimics-NC+TSHZ3-wt 組相比，miR-338-5p mimics+TSHZ3-wt 組的螢光素酶活性下降。Western blot結果顯示，過表達miR-338-5p可降低膀胱癌細胞中TSHZ3蛋白水平，表明miR-338-5p 對TSHZ3 具有靶向負調控作用。挽救實驗表明，過表達TSHZ3 部分抵消了miR-338-5p對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用，提示miR-338-5p 通過抑制TSHZ3 的表達促進膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲。

3.2 miR-338-5p及TSHZ3對Wnt/β-catenin信號通路的調控作用 研究表明，在人視網膜母細胞瘤Y79 細胞中轉染miR-338-5p 模擬物，lncRNA MBNL1-AS1 對細胞增殖、遷移的抑制作用以及對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用減弱，說明miR-338-5p 通過調控Wnt/β-catenin 信號通路促進Y79細胞的增殖和遷移［11］。Yao 等［13］研究發現miR-338-5p能夠通過調控Wnt8/β-catenin通路促進胰腺癌細胞的干性和進展。本研究證實，過表達miR-338-5p可上調膀胱癌UM-UC-3細胞內Wnt3a和βcatenin 蛋白表達水平，提示miR-338-5p 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究進一步探討了miR-338-5p 下游靶基因TSHZ3 對Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白的作用，結果顯示過表達TSHZ3可抑制Wnt3a和βcatenin 蛋白表達，說明TSHZ3 在膀胱癌內發揮抑癌作用可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，miR-338-5p 在膀胱癌中高表達，miR-338-5p 通過抑制TSHZ3 的表達促進膀胱癌的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與激活Wnt/βcatenin信號通路有關，這為miR-338-5p作為膀胱癌潛在治療靶點提供了理論基礎。