新型冠狀病毒核酸快速檢測與常規(guī)PCR檢測的結(jié)果比較*

李育敏,姚潔儀,郭東月,蔡毅華,付曉歌,張秀明

深圳市羅湖醫(yī)院集團醫(yī)學檢驗實驗室/廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,廣東深圳 518001

全球新型冠狀病毒(以下簡稱新冠病毒)仍在不斷發(fā)生變異,隨著國內(nèi)疫情防控政策的調(diào)整,新型冠狀病毒感染診療方案(試行第十版)中提出,新冠病毒檢測的方法主要有核酸檢測和抗原檢測[1],后者操作方便,但前者靈敏度更高,而在其診斷原則中新冠病毒核酸檢測陽性仍為確診的首要標準。新冠病毒核酸快速檢測(以下簡稱快檢)目前已被廣泛應用于臨床,大大縮短了陽性病例的檢出時間,使感染者能夠得到及時治療,對于住院患者也能夠在早期與其他非感染者進行分區(qū)治療。但由于分子診斷技術的專業(yè)性和復雜性,在實際應用和質(zhì)量管理過程中仍需要對其檢測結(jié)果的準確性和可靠性進行評價。按照《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應用專家共識》[2],本研究通過對新冠病毒核酸快檢系統(tǒng)與常規(guī)聚合酶鏈反應(PCR)兩種方法平行檢測樣本的結(jié)果進行比較,為臨床核酸快檢的應用及結(jié)果判讀提供參考。

1 材料與方法

1.1樣本來源 收集2022年2—8月在本實驗室采用快檢試劑和常規(guī)PCR試劑進行新冠病毒核酸檢測的所有咽拭子樣本。所有標本均嚴格按照《新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》[3]要求進行采集、送檢和保存。國家參考品為中國計量科學研究院新冠病毒核酸標準物質(zhì)[GBW(E)091089]。

1.2儀器與試劑 新冠病毒核酸提取儀器為重慶中元核酸提取儀,試劑為儀器配套的重慶中元核酸提取試劑(磁珠法)。新冠病毒核酸快檢儀器為杭州安譽AGS8830-8型(8通道)和AGS8830-16型(16通道)實時熒光定量PCR儀,試劑為中山大學達安基因新冠病毒核酸快檢試劑盒。新冠病毒核酸常規(guī)PCR檢測儀器為上海宏石SLAN-96S熒光定量PCR儀,試劑為上海伯杰新冠病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)。

1.3方法

1.3.1樣本處理和檢測 快檢和常規(guī)PCR檢測兩種方法均采用磁珠法提取核酸。將新冠病毒采樣管置于振蕩器上,振蕩10 min,按照重慶中元核酸提取試劑盒說明書提取核酸后,分別采用快檢和常規(guī)PCR兩種方法進行平行檢測,按照兩種方法的核酸檢測試劑盒說明書進行核酸擴增和結(jié)果判讀。

1.3.2檢出限 參照CNAS-CL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[4],使用定值標準物質(zhì)(國家參考品)的樣本,梯度稀釋至廠家聲明的檢出限水平(快檢試劑和常規(guī)PCR試劑均為500 copy/mL),采用新冠病毒核酸快檢和常規(guī)PCR兩種檢測方法分別對該水平樣本進行20次重復測定,室內(nèi)質(zhì)控在控時數(shù)據(jù)可接受。判斷標準為至少檢出18次靶核酸。

1.3.3方法符合率 參照CNAS-CL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[4],通過對快檢和常規(guī)PCR檢測兩種方法平行檢測樣本的結(jié)果進行比較,計算符合率,所統(tǒng)計的陽性樣本均為送至深圳市疾病預防控制中心(CDC)或深圳市羅湖區(qū)CDC復核后結(jié)果為陽性的樣本。

2 結(jié) 果

2.1兩種方法檢出限驗證 新冠病毒核酸快檢系統(tǒng)在500 copy/mL水平重復測定20次,雙靶標(ORF lab和N基因)同時檢出率為65%(13/20),其中單靶標N基因檢出率為100%(20/20),達到廠家聲明的檢出限;單靶標ORF lab基因檢出率為65%(13/20),未達到廠家聲明的檢出限。新冠病毒核酸常規(guī)PCR檢測試劑在500 copy/mL水平重復測定20次,雙靶標(ORF lab和N基因)同時檢出率為100%(20/20),達到廠家聲明的檢出限。

2.2臨床樣本檢測 2022年2—8月經(jīng)新冠病毒核酸快檢和常規(guī)PCR兩種方法平行檢測共189 600例樣本,快檢檢出陽性230例,常規(guī)PCR檢出陽性302例;快檢檢出的230例陽性樣本經(jīng)常規(guī)PCR檢測均為陽性,另有72例樣本快檢檢測為陰性,常規(guī)PCR檢測為陽性,其中41例快檢陰性樣本經(jīng)常規(guī)PCR檢測為雙靶標陽性(38例Ct值>35,3例Ct值<35);31例經(jīng)常規(guī)PCR檢測為單靶標陽性(20例單靶標N基因陽性,11例單靶標ORF lab基因陽性)。

2.3方法符合率 對189 600例樣本的檢測結(jié)果進行比較分析,兩種方法的陽性符合率為76.16%,陰性符合率為100.00%,總符合率為99.96%。見表1。

表1 新冠病毒核酸快檢和常規(guī)PCR檢測結(jié)果的比較(n)

3 討 論

按照《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應用專家共識》[2],新冠病毒核酸快檢相對于常規(guī)PCR檢測,檢測時間短、儀器便攜。目前國家藥品監(jiān)督管理局批準的新冠病毒核酸快檢試劑采用的方法有熒光PCR法、恒溫擴增-實時熒光法和全集成蝶式芯片法。尚有許多核酸快檢新興技術也在不斷研究發(fā)展[5-8]。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心發(fā)布的2022年全國新冠病毒核酸快檢室間質(zhì)評結(jié)果報告顯示,參與的2 389家實驗室中,成績合格的有2 373家(99.3%)。

本研究首先對新冠病毒核酸快檢系統(tǒng)和常規(guī)PCR檢測兩種方法的檢出限進行了評價,結(jié)果表明核酸快檢對N基因檢測可達到廠家聲明的檢出限,但對ORF lab基因檢測則未達到檢出限,而常規(guī)PCR方法檢測N基因和ORF lab基因均可達到廠家聲明的檢出限。進一步對189 600例臨床樣本的新冠病毒核酸檢測結(jié)果進行比對分析,快檢和常規(guī)PCR兩種方法的陽性符合率為76.16%,陰性符合率為100.00%,總符合率為99.96%,在快檢陰性、常規(guī)PCR檢測陽性72例樣本中,有41例為雙靶標陽性,但其中38例Ct值>35,僅3例Ct值<35,另外31例為單靶標陽性。以上研究結(jié)果表明,兩種方法檢測結(jié)果的一致性總體較好,但對于弱陽性樣本核酸快檢陽性檢出率低于常規(guī)PCR檢測,說明常規(guī)PCR檢測方法的靈敏度較快檢更高。

本研究在進行檢出限評價時,發(fā)現(xiàn)在500 copy/mL水平時重復測定20次,N基因可全部檢出,而ORF lab基因檢出率為65%,這可能與ORF lab基因和N基因檢測靈敏度的差異、ORF lab基因的拷貝數(shù)較低和多靶點擴增引物之間相互競爭等有關[9-10]。對快檢系統(tǒng)檢出單靶標基因的弱陽性樣本復核時,一方面可采取常規(guī)PCR試劑進行復核,另一方面可重復測定,如再次檢測出雙靶標陽性,可判斷為陽性;如仍為單靶標N基因陽性,按照國家相關文件規(guī)定重新采樣復核[2]。另外核酸提取和擴增效率也可影響靶基因的檢出率[11-12],部分廠家的核酸快檢系統(tǒng)可采用直接配套的核酸釋放劑,但有研究表明釋放劑法比磁珠法檢出的Ct值更大[11]。磁珠法具有自動化、操作簡單、快速等優(yōu)勢,釋放的核酸經(jīng)磁珠富集和純化后水平和純度均較高,更適用于不同水平及不同類型(單采和混采)的樣本檢測。本研究采用磁珠法提取核酸,再進行快檢試劑擴增檢測,重復性較好。此外,復陽個體體內(nèi)存在非活病毒,病毒序列不完整,檢測結(jié)果可能差異較大,如:不同的試劑檢出不同的單靶標;同一種試劑重復測定檢出不同的單靶標;檢出陽性后,重新采樣檢測陰性,連續(xù)多日陰性后又檢出陽性等。但是若個體再次感染新冠病毒變異株,體內(nèi)可能為活病毒。

新冠病毒核酸快檢并不完全等同于即時檢驗,其對實驗室建設和生物安全要求仍需遵循國家相關文件規(guī)定[2]。