環狀RNA UBAP2在結直腸癌患者中的表達及與預后的關系

劉佳貞,焦 瑞

1.楊凌示范區醫院肛腸外科,陜西咸陽 712199;2.西北大學附屬神木醫院消化內科,陜西榆林 719300

結直腸癌是由于多種基因或體細胞發生突變造成多條信號通路失調,導致腫瘤發生、發展和侵襲的異質性疾病,其在全世界范圍內發病率和病死率居高不下,且發病率呈增加的趨勢[1]。多數結直腸癌患者就診時已處于中晚期,5年生存率低。因此,找到一種行之有效的方法快速準確地進行疾病診斷和及時干預,對結直腸癌的臨床治療具有重要意義。環狀RNA是一種3′和5′末端以磷酸二酯鍵共價結合形成的環狀RNA分子,具有序列高度保守、環狀結構穩定、不易分解等特性,在哺乳動物細胞中廣泛表達。環狀RNA在轉錄后調控中發揮重要作用,通過多種途徑調控下游基因的轉錄和表達,與動脈粥樣硬化、肺纖維化、腫瘤、心力衰竭、阿爾茨海默病、心肌損傷等多種疾病有關,同時在不同的癌癥亞型中具有各自獨特的表達譜[2]。研究表明,環狀RNA泛素關聯蛋白2(UBAP2)是參與卵巢癌、神經膠質瘤、胰腺癌、食管癌等多種癌癥進展的關鍵調節因子,在癌細胞的惡性生物學行為中起著重要作用[3]。然而,目前環狀RNA UBAP2在結直腸癌中的作用仍未明晰。因此,本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測環狀RNA UBAP2在結直腸癌患者血清和癌組織中的表達水平,分析其與患者臨床病理特征和預后的關系,為結直腸癌的有效診治和預后提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月于楊凌示范區醫院住院進行手術的80例結直腸癌患者為研究對象。納入標準:(1)所有患者符合結直腸癌診斷標準[4];(2)術中成功獲取組織標本并保存完整,患者隨訪資料齊全;(3)患者入院前未進行過放療、化療或手術等治療。排除標準:(1)有結直腸癌手術史者;(2)其他部位惡性腫瘤者;(3)自身免疫性疾病者;(4)全身感染性疾病者;(5)臨床資料不完整者。另選取一般資料與結直腸癌患者匹配的80例同期門診健康體檢者為對照組。本研究遵循世界醫學協會赫爾辛基宣言,研究對象本人詳知此項研究內容,并自愿簽署同意書。

1.2方法

1.2.1標本收集 結直腸癌患者術前、健康對照者體檢當日采靜脈血3～5 mL于干燥試管中,以1 643.46×g的相對離心力進行離心,分離血清后分裝于無菌EP管中,于-20 ℃冰箱中保存待檢。結直腸癌患者術中切除的結直腸癌組織和癌旁組織置于凍存管中并投入液氮中保存,之后迅速轉移至-80 ℃冰箱保存待測。

1.2.2qRT-PCR檢測環狀RNA UBAP2表達水平 采用RNA提取試劑盒(上海生工生物有限公司)提取血清樣品總RNA,使用Trizol試劑(上海文韌生物科技有限公司)分離提取結直腸癌組織和癌旁組織總RNA。按反轉錄試劑盒(德國Qiagen公司)操作步驟反轉錄合成cDNA。qRT-PCR檢測環狀RNA UBAP2的表達水平。根據ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書設計反應體系,反應程序:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性10 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s,40個循環。在ABI(Applied Biosystems)7500 Fast系統上進行qRT-PCR反應。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參,根據公式2-ΔΔCt計算環狀RNA UBAP2基因的表達水平。基因引物經設計軟件設計后由上海生工生物工程有限公司合成,序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3結直腸癌患者臨床病理資料收集 收集結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤部位、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、分化程度等基本資料。

1.2.4隨訪 主要以電話及門診復查的方式對所有結直腸癌患者進行為期3年的隨訪,患者出現復發或死亡時則隨訪結束,患者隨訪率為100%,隨訪截至2022年6月。

2 結 果

2.1外周血標本中環狀RNA UBAP2的表達分析 結直腸癌患者外周血中環狀RNA UBAP2的表達水平為2.06±0.97,高于健康對照者的1.02±0.14,差異有統計學意義(t=9.491,P<0.001)。

2.2組織標本中環狀RNA UBAP2的表達分析 結直腸癌組織中環狀RNA UBAP2的表達水平為3.84±1.21,高于癌旁組織的1.05±0.16,差異有統計學意義(t=20.466,P<0.001)。

2.3結直腸癌組織環狀RNA UBAP2表達水平與患者臨床病理特征的關系 以結直腸癌組織環狀RNA UBAP2表達水平均值3.84為界限,≥3.84視為高表達,<3.84視為低表達,將結直腸癌患者分為環狀RNA UBAP2高表達56例,環狀RNA UBAP2低表達24例。結果顯示,結直腸癌組織環狀RNA UBAP2的表達水平與TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、分化程度有關(P<0.05),與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤部位無關(P>0.05)。見表2。

表2 結直腸癌組織環狀RNA UBAP2表達水平與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4結直腸癌組織環狀RNA UBAP2表達與患者預后的關系 直腸癌組織中環狀RNA UBAP2高表達患者3年生存率(39/56,69.64%)低于RNA UBAP2低表達患者(21/24,87.50%),差異有統計學意義(Log-Rankχ2=4.207,P<0.05)。見圖1。

圖1 結直腸癌組織環狀RNA UBAP2表達與患者3年 生存率的關系

2.5多因素COX回歸分析結直腸癌患者預后的影響因素 以結直腸癌患者3年內是否死亡為因變量(生存=0,死亡=1),以環狀RNA UBAP2表達水平(高表達=1,低表達=0)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ+Ⅳ期=1)、淋巴結轉移(有=1,無=0)、浸潤深度(深層=1,淺層=0)、分化程度(低分化=1,中/高分化=0)為自變量,以生存時間為時間變量,進行多因素COX回歸分析,結果顯示環狀RNA UBAP2、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、分化程度是結直腸癌患者預后的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素COX回歸分析結直腸癌患者預后的影響因素

3 討 論

結直腸癌的發生與遺傳、久坐不動、煙草、酒精的濫用等不良生活習慣有關,然而結直腸癌早期沒有明顯癥狀、不易察覺,隨著病情發展,常表現為便血、缺鐵性貧血、腹痛、腸梗阻、體質量減輕、食欲減退等,是一種復雜的多因素疾病[5]。結直腸癌可通過淋巴結、血液及腹膜發生轉移,大約20%的結直腸癌患者在診斷時已發生轉移,而發生轉移的結直腸癌更難治愈。快速準確的疾病診斷、及時的醫療干預可以幫助臨床醫生確診疾病并做出必要的治療決定,幫助患者康復。因此,迫切需要尋找有效的、與臨床相關的早期診斷標志物,這對提高結直腸癌的治療效果和改善患者預后具有重要意義。

環狀RNA是mRNA異常剪切的產物,對核酸酶不敏感,且比普通線性RNA更穩定,其不編碼蛋白質,但能夠調節基因表達,在細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程發揮重要的作用[6]。研究表明環狀RNA利用其環化作用競爭性抑制miRNAs的線性剪接和海綿功能,調節相應下游基因的表達,從而促進癌癥的發展[7]。環狀RNA UBAP2是一種新發現的環狀RNA,作為致癌基因也是多種腫瘤發生、發展的重要調控因子[8]。血清學指標在結直腸癌患者的病情監測方面起著重要的作用,其檢測方便、快速,且短期內可反復測量。本研究發現,結直腸癌患者血清中環狀RNA UBAP2的表達水平顯著高于健康對照者,提示環狀RNA UBAP2可能參與結直腸癌的發生過程,可作為結直腸癌早期診斷的潛在標志物。

XU等[9]發現環狀RNA UBAP2在卵巢癌組織和細胞系中表達上調,通過和下游miRNA結合,促進卵巢癌細胞增殖,抑制細胞凋亡。本研究發現結直腸癌組織中環狀RNA UBAP2表達水平顯著高于癌旁組織,提示環狀RNA UBAP2可能與結直腸癌的惡性程度有關,在結直腸癌的發展過程中,發揮促癌基因作用。WANG等[10]發現環狀RNA UBAP2在三陰性乳腺癌中高表達,且環狀RNA UBAP2高表達與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理特征及患者的預后不良有關。本研究將結直腸癌組織中環狀RNA UBAP2表達水平與患者臨床病理特征結合進行分析,發現環狀RNA UBAP2的表達水平與TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、分化程度有關,推測環狀RNA UBAP2可能是通過影響結直腸癌微環境中來參與其進展。研究進一步分析了80例結直腸癌患者3年隨訪資料,結果顯示環狀RNA UBAP2低表達的患者3年生存率較高。本研究同時進行了多因素COX回歸分析,結果顯示,環狀RNA UBAP2、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、分化程度是影響結直腸癌患者預后的因素。以上結果均提示環狀RNA UBAP2高表達預示著預后不良,可能作為促癌因子在結直腸癌的發生、發展中起作用。

綜上所述,結直腸癌患者血清和癌組織中環狀RNA UBAP2表達水平顯著升高,RNA UBAP2是影響結直腸癌患者預后的敏感指標。然而環狀RNA UBAP2參與結直腸癌發生、發展的具體機制仍需進一步探究。