東莨菪堿調節SIN3A表達對水楊酸誘導耳鳴大鼠mGluR5/Homer1信號通路的影響

顏微微 鄧可斌

耳鳴是一種聽覺幻覺,是一種在沒有聲音刺激的情況下感知聲音的現象,其被認為源于耳蝸和中樞神經系統,出現的原因可能與失眠、焦慮、抑郁、認知功能障礙和壓力等衰弱狀況有關[1]。目前還沒有能夠治療耳鳴的醫學設備,僅可以通過藥物、膳食補充劑或者助聽器來緩解,但治療效果并不顯著[2]。因此,研究耳鳴的潛在發病機制對開發新的治療方法至關重要。SIN3A是SIN3/組蛋白脫乙酰酶(HDAC)轉錄抑制復合物的中心支架蛋白,有研究發現SIN3A缺失會增加突觸支架Homer1的表達,改變代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)對海馬體長期記憶增強的依賴性[3,4]。Homer1是一種突觸后支架蛋白,位于突觸后密度區,其在情緒障礙和抗抑郁治療中起著重要作用,有研究已經證明了Homer1在耳鳴小鼠的聽覺皮層中被上調,而mGluR5抑制劑可以通過抑制Homer1表達而對耳鳴具有抑制作用[5,6]。東莨菪堿(Scopolamine,SPL)是一種莨菪烷型生物堿,它存在于茄科植物中,可用作中樞神經系統抑制劑,用于誘導神經系統損傷[7]。已有研究發現,SPL誘導的失憶癥與SIN3A的上調表達有關,而SIN3A的失調與包括Homer1在內的神經元即刻早期基因的表達相關[8]。已知SPL可以選擇性地增強大鼠嗅覺皮層中氣味表征的泛化,但對大鼠聽覺影響的研究還較少。因此,本研究通過水楊酸誘導大鼠耳鳴來探討SPL是如何調節SIN3A表達對耳鳴大鼠的mGluR5/Homer1信號通路產生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠:SPF級SD大鼠50只,8周齡180～220 g,購自于常州卡文斯實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(蘇)2021-0013。

1.1.2 主要試劑:氫溴酸東莨菪堿片(廣州白云山光華制藥股份有限公司,國藥準字H44020373);卡馬西平片(常州康普藥業有限公司,國藥準字H32021277);Trizol試劑(貨號:R401-01,南京諾唯贊生物科技股份有限公司);反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒(貨號:RR036A、RR820L,北京寶日醫生物技術有限公司);SIN3A、mGluR5、Homer1抗體(貨號:ab307197、ab76316、ab184955,英國abcam公司);山羊抗兔IgG(貨號:E-AB-1103,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組:將所有大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性組、SPL低、高劑量組,每組10只。除對照組外,其余組均按照文獻[9]方法對大鼠腹腔注射200 mg/kg的水楊酸鹽,2次/d,連續注射14 d。陽性組大鼠用劑量5 mg/kg的卡馬西平灌胃[10],SPL低、高劑量組分別以劑量為0.03 mg/kg、0.09 mg/kg的SPL灌胃給藥[11],對照組和模型組分別灌胃給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 驚跳反射前脈沖抑制(PPI)檢測:先將大鼠置于65 dB聲壓級的白色背景噪聲中,且固定在裝有壓力感受器的平臺上。測試時,先隨機給予大鼠10次115 dB聲壓級的脈沖刺激,然后利用揚聲器再對大鼠進行30次聲音刺激(10次115 dB的脈沖刺激,10次沒有脈沖的驚跳反射刺激,10次前脈沖驚跳反射刺激),前脈沖驚跳刺激分別用75 dB、80 dB、85 dB不同的聲強,記為PPI2、PPI4、PPI8,每次聲音刺激時間間隔為27～32 s。根據儀器記錄每組實驗大鼠的震驚反射幅度(ASR)以及PPI數值。計算PPI(%)=(1-PPI/ASR)×100%。

1.2.3 聽性腦干反應(ABR)檢測:先用1%的戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)大鼠,然后將大鼠放置在隔音箱的加熱毯上,針狀電極插入皮下,探查電極插入顱頂,參考電極插入左耳垂下,接地電極插入右耳垂下,將揚聲器按照校準的距離放在小鼠耳間軸的前面,先進行一個短聲刺激。然后開始測試實驗,測試聲強從85 dB開始,依次遞減5 dB,重復刺激,記錄各組大鼠的ABR閾值。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測大鼠聽皮層組織中SIN3A的mRNA水平:將大鼠麻醉處死后,摘取大鼠大腦并分離聽皮層,利用Trizol法提取部分聽皮層的總RNA,然后用反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA,反應體系為:5× PrimeScript Mix 4 μl,Random 1 μl,RNA模板 1 μl,加水至總體系20 μl。然后利用試劑盒配制qPCR反應體系:2×TB Green Premix Ex Taq II 10 μl,上下游引物各1 μl,cDNA模板1 μl,加水至總體系20 μl。反應程序:95℃預變性30 s;2步法:95℃變性10 s,60℃退火30 s,40個循環。以β-actin為內參,用2-ΔΔCt法計算SIN3A mRNA的相對表達量。引物序列:SIN3A:F-5’-TGTAGAGGGCCTGGTACCCT-3’,R-5’-ATGGGGACAGCATCTGGTTG-3’;β-actin:F-5’-GTCGTACCACTGGCATTGTG-3’,R-5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測大鼠聽皮層組織中SIN3A、mGluR5、Homer1蛋白的表達水平:取大鼠聽皮層組織加入蛋白裂解液提取總蛋白,并用BCA法測定蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白并轉至PVDF膜。然后將PVDF膜用5%脫脂牛奶在4℃封閉過夜,接著與一抗稀釋液(SIN3A、Homer1稀釋倍數1∶1 000,mGluR5稀釋倍數1∶5 000)在室溫中孵育1.5 h,再與羊抗兔IgG二抗(稀釋倍數1∶1 000)在室溫中孵育1.5 h,用顯影劑顯色。最后以β-actin為內參蛋白,用凝膠成像儀和Image J軟件分析蛋白條帶及灰度值。

2 結果

2.1 SPL對耳鳴大鼠PPI的影響 與對照組相比,模型組大鼠的PPI2、PPI4、PPI8均升高(P<0.05);與模型組相比,陽性組和SPL處理組大鼠的PPI2、PPI4、PPI8均降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠3種前脈沖刺激的PPI抑制率 n=10,%,

2.2 SPL對耳鳴大鼠ABR的影響 與對照組相比,模型組大鼠的ABR反應閾值升高(P<0.05);與模型組相比,陽性組和SPL處理組大鼠的ABR反應閾值降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠的ABR反應閾值 n=10,

2.3 SPL對耳鳴大鼠中SIN3A mRNA水平及蛋白的影響 與對照組相比,模型組大鼠的組織中SIN3A mRNA水平及蛋白均降低(P<0.05);與模型組相比,陽性組和SPL處理組大鼠的組織中SIN3A mRNA水平及蛋白均升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1,表3。

圖1 5組大鼠組織中SIN3A蛋白條帶;A 對照組;B 模型組;C 陽性組;D SPL低劑量組;E SPL高劑量組

表3 5組大鼠組織中SIN3A mRNA及蛋白的相對表達量 n=5,

2.4 SPL對耳鳴大鼠中mGluR5、Homer1蛋白的影響與對照組比較,模型組大鼠的組織中mGluR5、Homer1蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,陽性組和SPL處理組大鼠的組織中mGluR5、Homer1蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 5組大鼠組織中mGluR5、Homer1蛋白條帶;A 對照組;B 模型組;C 陽性組;D SPL低劑量組;E SPL高劑量組

表4 5組大鼠組織中mGluR5、Homer1蛋白的相對表達量 n=5,

3 討論

耳鳴是一種幻覺,是由于從耳蝸到大腦的聽覺神經纖維輸入減少而在大腦內產生的。在大多數情況下,這是由獲得性聽力損失引起的,并且只有當這種損失與聽覺和聽覺外腦網絡中明顯的神經元變化相結合時才會持續[12]。目前的治療方法包括教育和(或)咨詢、放松療法、耳鳴再訓練療法和耳級發聲器或助聽器,但不能治療潛在的感知[13]。因此,尋找針對耳鳴有效的治療方法依然是重中之重。

SPL是主要生物堿之一,存在于茄科的多種植物中,它們具有很強的抗膽堿能活性,并在中樞和外周毒蕈堿受體上作為乙酰膽堿的競爭性拮抗劑,并且在進入體內后可以穿透血腦屏障并與大腦皮層和皮層下區域的乙酰膽堿受體結合[14]。有研究發現低劑量的SPL能夠對抑郁癥小鼠產生抗抑郁作用,也能夠促進腦損傷后癲癇的緩解[11,15]。但對耳鳴大鼠的研究還較少,因此,本研究用水楊酸注射大鼠發現,模型組大鼠的前脈沖抑制率以及ABR閾值顯著高于對照組,揭示了水楊酸鹽成功誘導了大鼠耳鳴模型;而陽性藥物和SPL處理后,大鼠的前脈沖抑制率及ABR閾值低于模型組,表明SPL能夠抑制水楊酸誘導大鼠耳鳴,恢復大鼠聽力。

SIN3是一種進化上保守的核支架蛋白,作為基因轉錄的關鍵調節因子發揮作用,在哺乳動物細胞中有SIN3A和SIN3B兩個旁系同源物,其中SIN3A可以直接調節與細胞增殖、存活、代謝和應激反應有關的分子[16,17]。有研究證明SIN3A在神經元和非神經元細胞中均有表達,且能夠調節SPL誘導的認知障礙[18]。

本研究結果發現,模型組大鼠中SIN3A的mRNA和蛋白水平均降低,陽性藥物和SPL處理后SIN3A的mRNA和蛋白水平均升高。揭示了SPL能夠提高SIN3A的表達水平。據了解,SIN3A的減少會增加Homer1的表達并影響mGluR下游的信號級聯,從而調節海馬突觸的可塑性[4]。

Homer1是一種立即早期基因,隨著神經元活動的增加而表達,在興奮性突觸傳遞的穩態控制中起作用,可以很好地響應視覺體驗的變化[19]。mGluR5也是突觸可塑性、學習和記憶的重要調節劑,與精神分裂癥、阿爾茨海默病及重度抑郁癥等多種腦部疾病有關[20]。有研究已經指出Homer1在水楊酸鹽誘導的耳鳴大鼠中表達上調,且mGluR5的抑制劑也可以抑制Homer1的表達[6]。

本研究的結果顯示,模型組中mGluR5和Homer1的蛋白表達升高,陽性藥物和SPL處理組中mGluR5和Homer1的蛋白表達降低。揭示了SPL能夠抑制耳鳴大鼠中mGluR5/Homer1信號通路。我們推測可能是通過促進SIN3A的表達來抑制水楊酸鹽誘導的耳鳴大鼠中mGluR5和Homer1蛋白的上調。

綜上所述,SPL可以通過促進SIN3A的表達,來抑制水楊酸誘導的耳鳴大鼠mGluR5/Homer1信號通路,從而緩解大鼠的耳鳴。本研究為治療耳鳴提供了新的藥物及研究思路。但本研究中SPL劑量太高可能會誘導大鼠產生認知障礙,因此,針對該藥物在臨床上的治療劑量還需要進一步深入研究。