GLS1通過激活Nrf2/HO-1軸抑制過氧化氫誘導的ARPE-19細胞氧化應激、自噬與凋亡

周洋 美麗巴努·玉素甫 陳婷妍

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種復雜的眼部疾病,是老年人群不可避免的眼部問題。ARMD多發于>50歲的老年人群,是導致老年人失明的重要原因之一。目前ARMD的發病機制尚不明確,但是已有研究表明,ARMD發病與氧化應激、炎癥、自噬、凋亡等相關[1-3]。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)位于脈絡膜與視網膜神經上皮層之間,容易受到氧化應激的影響,導致細胞內自噬再循環和降解減少,進一步誘導炎癥的發生[4,5]。因此,改善RPE的病理狀態對于ARMD的治療至關重要。谷氨酰胺酶1(glutaminase1,GLS1)是谷氨酰胺-谷氨酸循環途徑中的限速酶,可通過分解谷氨酰胺而提供細胞快速增殖所需的重要能量[6]。Johmura等[7]研究表明,GLS1是抑制衰老的重要靶點,GLS1分解谷氨酰胺產生的氨中和了衰老細胞中的酸中毒,使得衰老細胞死亡趨于正常化。Liu等[8]研究表明,GLS1可調控腸癌的自噬。GLS1對ARMD的影響尚無探究,本文通過H2O2誘導視網膜色素上皮細胞ARPE-19的氧化應激,探究了GLS1對H2O2誘導的ARPE-19細胞氧化應激、自噬和凋亡的影響,旨在為ARMD的臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 視網膜色素上皮細胞ARPE-19(購自中科院上海細胞庫);過氧化氫H2O2(購自南京化學試劑有限公司);Lipofectamine 2000試劑盒(購自賽默飛世爾科技有限公司);CCK-8試劑盒(購自沈陽萬類生物科技有限公司);細胞凋亡檢測試劑盒(購自沈陽萬類生物科技有限公司);活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒(購自購自上海碧云天生物技術有限公司);Nrf2、HO-1、LC3-Ⅱ、p62、GAPDH、山羊抗兔IgG(購自Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 ARPE-19細胞培養與H2O2誘導

1.2.1 取液氮保存的ARPE-19細胞,于37℃水浴鍋中迅速解凍,然后將細胞懸液轉移至離心管中,1 000 r/min離心5 min,收集細胞沉淀,用10 ml的含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸,然后轉移至細胞培養皿中,細胞培養皿中置于37℃,5%CO2細胞培養箱中,細胞隔天更換培養基,細胞生長至匯合度達80%時進行細胞傳代。

1.2.2 H2O2誘導濃度篩選:使用 0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2分別誘導 ARPE-19 細胞48 h,根據CCK-8法檢測各組 ARPE-19 細胞活力,選擇ARPE-19 細胞活力顯著下降為50%時的H2O2濃度作為本研究的H2O2誘導濃度。

1.3 分組 ARPE-19 細胞分為對照組、H2O2組、H2O2+ Vector組、H2O2+ GLS1組,對照組細胞不做任何處理,H2O2組使用200 μmol/L H2O2誘導 ARPE-19 細胞48 h,H2O2+ Vector組ARPE-19 細胞轉染GLS1空白載體后使用300 μmol/L H2O2誘導 48 h,H2O2+ GLS1組ARPE-19 細胞轉染GLS1過表達載體后使用300 μmol/L H2O2誘導48 h。

1.4 細胞轉染 根據 Lipofectamine 2000試劑盒說明書,轉染前1 d將2×105個ARPE-19細胞接種至6孔板中,轉染前將6孔板中的培養基更換為800 μl無血清的DMEM培養基,5 μl GLS1空白載體或者GLS1過表達載體用無血清的DMEM培養基稀釋至125 μl,5 μl Lipofectamine 2000試劑稀釋至125 μl,然后將上述稀釋液混勻,室溫放置15 min,然后將混合液加入到6孔板中,37℃,5%CO2細胞培養箱中孵育24 h后將6孔板中的培養基更換為含10%胎牛血清的DMEM培養基,繼續培養24 h后所得細胞進行在進行H2O2誘導。

1.5 CCK8法檢測細胞活力 將對數生長期的ARPE-19 細胞稀釋至5×104個/ml,96孔板每孔接種100 μl,細胞完全貼壁后,將孔內細胞培養基更換為100 μl含0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2細胞培養基,培養24 h后每孔加入10 μl CCK8溶液,37℃條件下培養2 h,然后使用酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度值(OD值),細胞活力(%)=(OD加藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%,細胞不加H2O2處理為對照組,空白孔不接種細胞,僅有100 μl培養基。

1.6 比色法測定 SOD、GSH和MDA濃度 消化并收集對照組、H2O2組、H2O2+ Vector組、H2O2+ GLS1組ARPE-19 細胞1×105個細胞,每組細胞用500 μl PBS重懸,細胞懸液進行超聲震蕩破碎,破碎液稀釋至5 ml,根據 SOD、GSH、MDA 檢測試劑盒檢測各組細胞中 SOD、GSH和MDA含量。

1.7 透射電鏡觀察自噬小體 將各組ARPE-19細胞去除培養基,用PBS洗滌2次后,用2.5%戊二醛固定過夜,然后用1%鋨酸固定2 h,依次用50%、70%、90%、100%的丙酮脫水,包埋,染色后,在透射電鏡下觀察各組細胞自噬小體的數量。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組ARPE-19細胞PBS漂洗細胞2次,并收集5×105個細胞,每組細胞加入500 μl Binding buffer重懸細胞,分別加入5 μl Annexin V-FITC混勻后,加入10 μl Propidium Iodide混勻,室溫避光反應15 min,Annexin V-FITC熒光信號通過FL1通道檢測,Propidium Iodide熒光信號通過FL2通道檢測,每次檢測需要同時檢測Annexin V-FITC單陽性管、Propidium Iodide(PI)單陽性管,用于調節熒光補償數值。

1.9 Western blot 使用RIPA蛋白提取試劑盒提取對照組、H2O2組、H2O2+ Vector組、H2O2+ GLS1組ARPE-19細胞的總蛋白,取10 μg蛋白在80 V條件下進行SDS-PAGE凝膠電泳120 min,使用PVDF膜轉膜90 min后,PVDF膜封閉1 h,然后將PVDF膜與GLS1、Nrf2、HO-1、LC3-Ⅱ、p62、GAPDH抗體4℃孵育過夜,TBST清洗3次后,用1∶2 000比例稀釋的山羊抗體IgG室溫孵育1 h,洗膜,使用ECL試劑盒顯影,拍照,使用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

2 結果

2.1 不同濃度H2O2對ARPE-19細胞活力的影響 ARPE-19細胞分別用0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2處理24 h后,細胞活力分別為(100.00±0.00)%、(93.28±2.70)%、(75.47±4.77)%、(51.33±2.89)%、(36.32±5.71)%、(23.56±3.93)%、(13.70±3.30)%,200、300、400、500、600 μmol/L H2O2誘導的ARPE-19細胞活力均顯著下降(P<0.05),300 μmol/L H2O2誘導的ARPE-19細胞活力為(51.33±2.89),選擇300 μmol/L H2O2濃度最為ARPE-19細胞的誘導濃度。見表1。

表1 不同濃度H2O2對ARPE-19細胞活力的影響 n=5,%,

2.2 GLS1抑制H2O2誘導的ARPE-19細胞氧化應激 與對照組比較,H2O2組和H2O2+ Vector組ARPE-19細胞中SOD、GSH濃度含量顯著下降(P<0.001),MDA濃度顯著增加(P<0.001),并且H2O2組和H2O2+ Vector組上述指標無顯著差異(P>0.05)。與H2O2+ Vector組比較,H2O2+ GLS1組ARPE-19細胞中SOD、GSH濃度含量顯著增加(P<0.001),MDA濃度顯著下降(P<0.001),說明GLS1可抑制H2O2誘導的ARPE-19細胞SOD、GSH和MDA的變化,即抑制H2O2誘導的ARPE-19細胞氧化應激。見表2。

表2 4組ARPE-19細胞SOD、GSH、MDA濃度比較 n=5,

2.3 GLS1抑制H2O2誘導的ARPE-19細胞自噬 透射電鏡觀察結果顯示,H2O2組ARPE-19細胞接受H2O2誘導后其自噬小體數顯著高于對照組(P<0.05),LC3-Ⅱ表達顯著增加(P<0.001),P62表達顯著降低(P<0.05),H2O2+GLS1組ARPE-19細胞自噬小體顯著低于H2O2+Vector組(P<0.05),LC3-Ⅱ表達顯著降低(P<0.05),P62表達顯著增加(P<0.05),說明GLS1抑制H2O2誘導的ARPE-19細胞自噬水平。見表3、4,圖1、2。

圖1 透射電鏡下觀察各組細胞自噬小體的數目(×100 000)

表3 4組ARPE-19細胞自噬小體數比較 n=5,個,

表4 4組ARPE-19細胞LC3-Ⅱ和P62表達比較n=5,

2.4 GLS1抑制H2O2誘導的ARPE-19細胞凋亡 流式細胞術檢測結果顯示,與對照組比較,H2O2組ARPE-19細胞凋亡率顯著增加(P<0.05),說明H2O2可誘導ARPE-19細胞凋亡。H2O2+GLS1組ARPE-19細胞凋亡率顯著低于H2O2+Vector組(P<0.05),說明過表達GLS1可抑制H2O2所引起的細胞凋亡。見圖3,表5。

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平

表5 4組ARPE-19細胞凋亡率比較 n=5,%,

2.5 GLS1激活Nrf2/HO-1信號軸 Western blot檢測結果顯示,與對照組比較,H2O2組ARPE-19細胞中Nrf2和HO-1表達顯著下調(P<0.05),H2O2組和H2O2+ Vector組Nrf2和HO-1表達無顯著差異,與H2O2+ Vector組比較,H2O2+GLS1組ARPE-19細胞Nrf2和HO-1表達顯著上調(P<0.05),即Nrf2/HO-1信號通路顯著激活。見圖4,表6。

圖4 Western blot檢測4組ARPE-19細胞Nrf2和HO-1表達

表6 4組ARPE-19細胞Nrf2和HO-1表達比較 n=5,

3 討論

ARMD是世界性失明的主要原因之一,隨著年齡的增加,其發病率逐漸增加。目前ARMD的治療方式僅能緩解,但是并沒有治愈的有效手段。雖然ARMD發生發展的機制還不明確,但是有研究表明ARMD的發生與炎癥和氧化應激等密切相關[9,10]。在病理研究指出,視網膜色素上皮細胞對于正常視網膜健康和功能是至關重要的,視網膜色素上皮細胞對于損害和功能障礙高度敏感,因此是ARMD的首先起病理變化的位置[11,12]。氧化應激是引發視網膜色素上皮細胞功能損傷的病理原因,氧化應激引起的氮自由基和高活性分子氧自由基的激增導致嚴重的細胞凋亡[13],因此,有研究指出,抑制氧化應激是緩解視網膜色素上皮細胞損傷的重要方法。由于黃斑僅存在于靈長類的動物,因此體內ARMD的研究存在一定的困難,所以使用保持原代細胞的功能和形態學特征的視網膜色素上皮細胞可作為ARMD研究的模型。化學氧化劑、高氧環境和給予光感受器外節膜盤或脂褐質均可誘導視網膜色素上皮細胞的氧化應激,其中,H2O2是一種重要的活性氧,H2O2可誘導細胞發生Fenton 反應,使細胞內單態氧、羥自由基等不斷堆積,進而促進細胞的損傷,H2O2誘導視網膜色素上皮細胞ARPE-19可作為ARMD研究的細胞模型[14,15]。本研究使用0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2誘導ARPE-19細胞,300 μmol/L H2O2對ARPE-19細胞活力的抑制率約為50%,因此,本研究選擇300 μmol/L H2O2誘導ARPE-19細胞的氧化應激及損傷。

GLS1是谷氨酰胺-谷氨酸循環途徑中的限速酶,可為細胞的生長提供能量。有研究指出,GLS1可緩解酸中毒進而減緩細胞的衰老,可作為改善衰老的重要靶點[6]。研究表明GLS1可調控腫瘤的自噬、凋亡以及氧化應激[16],但是GLS1對ARMD的影響報道較少。本研究在ARPE-19細胞中轉染GLS1后在以300 μmol/L H2O2誘導,并且發現過表達GLS1后,ARPE-19細胞中自噬小體數顯著減少,說明細胞自噬顯著減少;SOD、GSH濃度含量顯著增加,MDA濃度顯著下降,說明細胞氧化應激被顯著抑制;細胞凋亡顯著減少。研究表明,細胞凋亡和自噬與氧自由基密切相關,氧自由基可引起細胞膜脂質過氧化,破壞細胞膜、細胞內蛋白質及核酸結構和功能,促使細胞凋亡[17]。說明GLS1可緩解氧化應激引起的凋亡和自噬。亦有研究指出,細胞內氧自由基堆積,可引起MDA的大量生成,SOD 作為細胞內最重要的氧自由基清除劑,GSH是一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的重要過氧化物分解酶,二者均可抑制細胞內的氧化應激[18,19],說明GLS1可通過影響細胞內的SOD、GSH和MDA的表達而緩解細胞的氧化應激。

Nrf2/HO-1信號通路是與氧化應激密切相關的信號通路,在氧化應激的條件下,激活的Nrf2可與 Keap-1解離,進而轉移至細胞核內,與核內抗氧化劑反應元件相互作用,進而調控HO-1,催化血紅蛋白降解,形成內源性抗氧化保護系統,減弱氧化應激,同時抑制促凋亡蛋白酶[20]。并研究發現在轉染GLS1后ARPE-19細胞內Nrf2和HO-1表達顯著上調,說明GLS1通過激活Nrf2/HO-1信號通路而抑制氧化應激引起的損傷。

綜上所述,GLS1可緩解H2O2誘導ARPE-19細胞氧化應激、自噬以及凋亡,其機制可能為激活Nrf2/HO-1信號通路,但GLS1能否作為ARMD治療的新靶點還需進一步探究。