整合素α5β1在Hartley豚鼠自發(fā)性骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨退變中的作用研究*

李 遠,李 忠,劉俊才△

(1.遂寧市中心醫(yī)院骨科中心三病區(qū)-關節(jié)外科,四川 遂寧 629000;2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科/四川省骨科置入器械研發(fā)應用技術工程實驗室,四川 瀘州 646000)

骨關節(jié)炎(OA)是骨科臨床最常見的慢性關節(jié)疾病,會導致關節(jié)疼痛并增加患者的經(jīng)濟負擔。由于OA的病因及發(fā)病機制目前尚不清楚,臨床僅能以延緩進展、緩解癥狀及晚期矯正畸形、改善功能為治療目的。因此,原發(fā)性OA的防治一直是醫(yī)學領域研究的熱點和難點問題[1]。 近期研究發(fā)現(xiàn),阻斷整合素α5β1表達時,有利于抑制大鼠視網(wǎng)膜炎性反應及血管增生,改善視網(wǎng)膜剝脫[2]。α5β1在軟骨細胞力學信號轉(zhuǎn)導中的作用最為突出[3]。KHALILI等[3]研究發(fā)現(xiàn),ATN-161是整合素α5β1的拮抗劑,整合素α5β1來源于人纖連蛋白的協(xié)同域(PHSRN),其中半胱氨酸殘基取代了原序列(PHSCN)中的精氨酸。一些研究表明,在幾種腫瘤模型中,無論是作為單一藥物還是與放化療聯(lián)合使用,ATN-161都能抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和延長患者生存期[3-5]。雖然整合素α5β1在OA 及關節(jié)軟骨中的研究有不少報道,但其特異性拮抗劑ATN-161在膝OA及軟骨退變中的研究在國內(nèi)外還鮮見報道。據(jù)此,本研究擬觀察不同月齡豚鼠原發(fā)性 OA模型中疾病進展的相關病理改變,進一步研究 ATN-16 對 OA 的治療效果及機制,從而為臨床運用 ATN-161 治療 OA 提供可靠的理論依據(jù)和技術支持。

1 資料與方法

1.1實驗動物分組 選取3周齡的SPF級Hartely雌性豚鼠24只,進行1周的適應性喂養(yǎng)并記錄初始體重并對其進行編號,然后采用隨機分配法將24只豚鼠隨機分為基線組、對照組、ATN-161治療組、生理鹽水治療組,每組6只。其中基線組的豚鼠在實驗開始時處死,對照組的豚鼠正常飼養(yǎng)3個月齡時處死,ATN-161的豚鼠在正常飼養(yǎng)3個月后開始予以ATN-161腹腔注射1 mg/(kg·3 d)直至3個月后處死,生理鹽水治療組的豚鼠在正常飼養(yǎng)3個月后開始予以生理鹽水腹腔注射1 mg/(kg·3 d)直至3個月后處死。

1.2方法

1.2.1標本的采集和處理 膝關節(jié)軟骨標本的選取及組織蠟塊制作:動物在預定處死時間用頸椎脫臼法處死。動物處死后馬上在無菌條件下解剖暴露雙后肢膝關節(jié),肉眼大體觀察關節(jié)面的色澤、光滑度、滑液性狀及有無關節(jié)面破損并留取影像資料。依據(jù)Outerbridge標準,以稅利手術刀片在股骨內(nèi)髁關節(jié)負重面同一區(qū)域切取軟骨標本各6例,大小約1 cm×0.5 cm×0.5 cm,將軟骨標本置于10%中性甲醛溶液內(nèi)固定48 h,流水沖洗2～3 h,混合酸脫鈣液脫鈣24～48 h,直至大頭針能輕松穿透標本,再流水沖洗2～3 h,10%中性甲醛溶液內(nèi)固定24 h后,常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋,制成組織塊備用。軟骨標本蘇木精-伊紅(HE)及特殊染色,顯微組織學觀察,Mankin評分及造模成功以及自發(fā)性骨關節(jié)為進行性判定:軟骨組織塊3～5 μm厚度全層垂直切片,HE染色制片、番紅-固綠與阿利新藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)特殊染色制片及顯微鏡下形態(tài)學觀察,觀察軟骨表面是否規(guī)則、有無裂隙,細胞數(shù)量、分布、排列是否規(guī)則,特染著色部位、分布、均勻度及深淺。根據(jù)Mankin評分將軟骨損傷(OA)組織病理學改變分為4期。正常軟骨 0分;輕度OA 1～<6分;中度OA 6～<10分;重度OA 10～<15分。

1.2.2干預后Hartely豚鼠膝關節(jié)軟骨的檢測指標及方法

1.2.2.1檢測指標 大體形態(tài)學觀察、HE組織學觀察、氧化應急指標觀察[基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13]、力學傳導(整合素α5β1)、細胞凋亡(Bax、bcl-2)。檢測方法:大體形態(tài)學觀察:股骨內(nèi)髁負重關節(jié)面的大體形態(tài)學改變,包括關節(jié)軟骨的光滑度、色澤、表面是否有糜爛及潰瘍、是否有纖維增生及邊緣是否有骨贅形成。HE組織學觀察參照Mankin評分標準。血炎癥、力學傳導、血管生成、細胞凋亡指標觀察參照Chemicon公司購買相應檢測檢測試劑盒檢測結果評定標準。為了提高檢測準確性,整合素α5β1、Bax、bcl-2的檢測采用免疫組化方法。

1.2.2.2免疫組織化學檢測 采用免疫組化(SP)法染色,其中抗人整合素α5β1抗體1∶100稀釋,二甲聯(lián)苯胺(DAB)室溫下顯微鏡下調(diào)控顯色。SP法結果判定參照Jacobs評定方法,由3名病理專業(yè)高級職稱醫(yī)師獨立讀片,其評定誤差控制在5%以內(nèi),取三者平均值作為最后判定結果;選取5～10個高倍視野(400×),計數(shù)每個視野中細胞總數(shù)、陽性細胞數(shù)及著色程度,顯微鏡下胞漿或包膜有棕黃色顆粒為陽性細胞;用陽性細胞積分作為整合素α5β1的表達量。依照陽性細胞所占比例分為:0～<25%記為弱陽性(+),25%～<50%記為中等陽性(++),50%～100%記為強陽性(+++)。依照細胞陽性著色程度(抗原含量)分為:弱陽性(+)記為1分,中等陽性(++)記為2分,強陽性(++)記為3分。積分綜合計量,積分=弱陽性(+)%×1 +中等陽性(++)%×2+強陽性(+++)%×3,積分<1.0者為(+),1.0～1.5者為中等陽性(++),>1.5者為強陽性(+++)。

2 結 果

HE染色組織學和 Mankin 評分結果顯示,對照組豚鼠在3月齡時即發(fā)生了OA樣改變,并且隨著月齡的增長退變逐漸加重,確定造模成功。見表1。組織學和 Mankin 評分結果發(fā)現(xiàn)(圖2、表2),對照組豚鼠在3個月時即發(fā)生了OA樣改變,并且隨著年齡的增長退變逐漸加重,通過 ATN-161治療后,ATN-161治療組豚鼠在6月齡時Mankin評分分值明顯減少(P<0.05)。SP法結果證實,α5β1 的表達(圖2)在基線組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),之后隨著月齡的增加。生理鹽水組中整合素α5β1 的表達高于對照組(P<0.05):與生理鹽水組比較,ATN-161組治療后能明顯降低整合素α5β1的表達(P<0.05);隨著豚鼠年齡的增加,MMP-3 在軟骨中的表達增多(圖3),對照組明顯高于 BL組,生理鹽水組又顯著高于對照組(P<0.05);細胞凋亡指標(Bax、bcl-2)(圖4、5)免疫組織化學指標均顯示:基線組、對照組、ATN-161治療組三組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中Bax在對照組表達量最低,基線組中最高,ATN-161治療組表達量明顯高于對照組(NS組)(P<0.05);此外,bcl-2在對照組表達量最高,基線組中最低,ATN-161治療組表達量明顯低于生理鹽水治療組(P<0.05)。見表3、4。

注:A.基線組膝關節(jié)關節(jié)軟骨表面光滑、完整;B.對照組可見關節(jié)面稍微粗糙,軟骨表面可見輕微的纖維化樣改變;C.生理鹽水治療組關節(jié)面粗糙,不平整,軟骨表面出現(xiàn)纖維化改變,切片中細胞排列紊亂,大小不均;D.ATN-161治療組部分區(qū)域關節(jié)面較為平整,表層及移行層內(nèi)軟骨細胞增多,胞體腫大。

注:A.基線組α5β1 表達較強,陽性細胞數(shù)量多,著色區(qū)域廣、著色深;B.對照組α5β1 著色區(qū)域、顏色較 BL 組都有所減少;C.生理鹽水治療組α5β1 著色區(qū)域少顏色很淺;D.ATN-161治療組α5β1 表達廣泛,著色深。

注:A.基線組MMP-3 則基本無表達,著色區(qū)域小;B.對照組MMP-3 著色區(qū)域、顏色較 BL 組都有所增加;C.生理鹽水治療組MMP-3 表達廣泛,顏色深;D.ATN-161治療組MMP-3 在軟骨淺層區(qū)域有表達,范圍小,顏色淺。

注:A.基線組;B.對照組;C.生理鹽水治療組;D.ATN-161治療組。

注:A.基線組;B.對照組;C.生理鹽水治療組;D.ATN-161治療組。

表1 豚鼠體重體重變化情況

表2 Mankin評分結果分,n=8)

表3 定量分析α5β1和MMP-13指標的免疫組化結果

表4 定量分析BXA和Bcl-2的免疫組化結果

3 討 論

OA的特征是關節(jié)軟骨進行性喪失,軟骨下骨硬化和滑膜炎癥,是當今最常見的慢性疾病之一。 因此OA動物模型的制作對于研究疾病的發(fā)生發(fā)展至關重要。Dunkin-Hartley(DH)豚鼠自發(fā)性骨關節(jié)炎模型在國內(nèi)外文獻中廣泛報道[6-8]。Hartely豚鼠自發(fā)性 OA 模型的優(yōu)點在于:(1)Hartely豚鼠的OA隨月齡的增加而逐漸加重,這在很大程度上避免了由手術方式、藥物誘導造OA模型對實驗本身的影響;(2)Hartely豚鼠OA的膝關節(jié)軟骨在形態(tài)學、影像學、生物化學等方面均與人類OA病理相似,這將更有利于人類OA的研究。本實驗采用Hartely豚鼠作為動物模型,有效模擬了人類OA的發(fā)生發(fā)展過程,為研究ATN-161對 OA的軟骨和軟骨下骨的作用提供有效保障。本研究結果顯示,隨著豚鼠月齡的增長,體重逐漸增加,這與既往關于DH豚鼠制作骨關節(jié)炎模型的研究結論相吻合[9-10],因此說明本實驗成功復制了 OA動物模型。ATN-161是整合素α5β1的拮抗劑,能抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和延長生存期[3-5]。既往研究表明,ATN-161在抑制腫瘤血管生成和其他類型腫瘤轉(zhuǎn)移中有重要作用,但在其特異性拮抗劑ATN-161在膝OA及軟骨退變中的研究在國內(nèi)外還鮮見報道。

WANG 等[11]研究結果表明,軟骨細胞自噬的功能可能至少部分涉及糖原的分解代謝。 因此,在患有OA的豚鼠中,脛骨平臺軟骨細胞自噬水平降低,軟骨細胞無法將細胞內(nèi)糖原降解為葡萄糖,導致軟骨細胞能量減少,細胞凋亡增加。大量研究表明,Notch信號通路在調(diào)控軟骨細胞增殖、分化,維持軟骨表型及軟骨基質(zhì)代謝方面有重要作用。MOQBEL 等[12]研究發(fā)現(xiàn)線粒體融合促進軟骨祖細胞(CPSCs)的軟骨形成分化。mitofusin 2(Mfn2) 通過 Notch2 加速 CPSCs 的軟骨形成分化。 在體內(nèi),rCPSCs 片中的 Mfn2-OE 改善了大鼠模型中的 OA。ZAMLI等[13]研究認為,在Hartely豚鼠自發(fā)性骨關節(jié)炎模型中,骨關節(jié)炎病程進展同軟骨細胞凋亡的增加有關。吳紹軍等[14]研究發(fā)現(xiàn),Notch信號通路的激活與抑制可以通過凋亡途徑改變Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達情況從而影響大鼠OA的進展。本研究中發(fā)現(xiàn),ATN-161組豚鼠關節(jié)軟骨免疫組化結果也出現(xiàn)了凋亡指標BXA的下調(diào)和Bcl-2上調(diào)的變化,充分表明該阻斷劑能在一定程度上減緩骨關節(jié)軟骨退變速度,可抑制Notch信號通路發(fā)揮作用。有研究將Notch 信號傳導的下游效應物確定為疾病改善骨關節(jié)炎藥物的潛在靶標[15]。本研究表明,ATN-161能對整合素α5β1起到直接的抑制作用,減少MMP-13的表達,減輕軟骨的降解,下調(diào) Bax 蛋白,上調(diào) Bcl-2 蛋白,從而抑制軟骨細胞凋亡,進而保護關節(jié)軟骨,減緩關節(jié)軟骨的退變速度。ATN-161 可能是一種骨關節(jié)炎治療候選藥物。

AMRUTA等[16]通過ATN-161 處理(10 μmol/L) 通過減少整合素α5、MMP-9和纖連蛋白的表達,以及通過減少線粒體超氧化物自由基、細胞內(nèi)ROS、炎癥來減少氧化應激,有效抑制OGD/R誘導的細胞外基質(zhì)(ECM)沉積通過減少NLRP3炎性體,通過降低claudin-5和ZO-1表達水平導致緊密連接丟失,通過抑制線粒體去極化導致線粒體損傷,通過調(diào)節(jié)磷酸化黏著斑激酶(p-FAK)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)水平導致細胞凋亡。SUN等[17]研究表明,咖啡酸苯乙酯(CAPE)增加聚集蛋白聚糖和膠原蛋白Ⅱ的表達,以及降低MMP-3、MMP-13和具有整合素α5β1和金屬蛋白酶的表達來減弱細胞外基質(zhì)的降解。可能是預防或治療OA的潛在治療劑。總之,本研究結果進一步支持用ATN-161治療性靶向抑制整合素α5β1改善豚鼠關節(jié)軟骨的形態(tài),降低氧化應急性損傷,抑制軟骨基質(zhì)中金屬蛋白酶MMP-13的表達,進而對骨關節(jié)炎起到一定治療作用。

整合素是廣泛存在于人體免疫細胞中的跨膜受體,參與慢性炎癥、血栓形成、惡性腫瘤形成等病理過程。它們主要介導細胞間黏附,協(xié)調(diào)細胞外基質(zhì)成分的攝取,調(diào)節(jié)細胞骨架的形成,從而調(diào)節(jié)細胞信號傳導[18-19]。TAO 等[20]從小鼠的膝蓋軟骨分離細胞,并在各種濃度的纖連蛋白(FN)存在下進行培養(yǎng)并在體外進行增殖,遷移和軟骨形成分化測定發(fā)現(xiàn),FN通過整合素α5β1依賴性信號通路增強軟骨形成祖細胞(CPC)增殖,遷移和軟骨形成分化。基于這些結果,可以開發(fā)出一種針對FN靶向激活軟骨形成祖細胞(CPC)的新穎而有前途的療法,以在臨床環(huán)境中治療軟骨損傷。ATN-161作為整合素α5β1的特異性阻斷劑。本研究發(fā)現(xiàn),實驗組豚鼠整合素α5β1明顯下降,且關節(jié)軟骨大體形態(tài)和組織化學染色評分均高于對照組,這表明ATN-161可能是一種潛在的治療藥物。本研究著重觀察了 ATN-161對 DH 豚鼠自發(fā)性 OA 軟骨改變和保護作用,其具體的作用機制還需要今后進一步研究;此外,鈣化軟骨是軟骨的一部分,也是軟骨和軟骨下骨重要的連接組織,在OA 中也起著至關重要的作用,ALN 對軟骨都具有保護作用,然而ALN 對鈣化軟骨的作用和機制,也是以后的研究需要補充完善的內(nèi)容。