基于NF-κB p65通路研究自擬五倍子湯對大鼠肛瘺術(shù)后鎮(zhèn)痛及炎癥抑制的作用機制*

袁泉良,張慶東,郭躍,趙文博

1.南陽市中心醫(yī)院,河南 南陽 473009; 2.河南省省立醫(yī)院,河南 鄭州 450000

肛瘺(anal fistula,AF)是一種臨床常見消化系統(tǒng)疾病,指肛管或直腸與肛門周圍皮膚之間形成異常肉芽膿性管道,出現(xiàn)膿腫、潰爛等現(xiàn)象,主要與肛腺感染相關(guān)[1]。近年來,AF發(fā)病率急劇攀升,且復(fù)發(fā)率高,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2-3]。AF難以自愈,臨床中常采用手術(shù)方式治療,但由于手術(shù)部位的特殊性一般不予縫合,創(chuàng)面大、愈合緩慢和病程長使術(shù)后常出現(xiàn)流膿、水腫、瘙癢、出血和疼痛現(xiàn)象等并發(fā)癥,還會出現(xiàn)身形消瘦和體溫升高等癥狀[4-6]。因此,亟須尋找安全有效的治療藥物解決術(shù)后疼痛和炎癥問題,對提高患者生活質(zhì)量有著重大意義。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)治療AF具有豐富的臨床經(jīng)驗,將AF稱為“肛漏”,根據(jù)中醫(yī)藥理論,借鑒古代及現(xiàn)代中醫(yī)藥臨床使用經(jīng)驗,選取具有治療痔瘡脫肛作用的五倍子湯來治療AF[7-8]。本研究通過建立AF大鼠模型,探討自擬五倍子湯對AF大鼠術(shù)后鎮(zhèn)痛、炎癥反應(yīng)的抑制作用及其可能作用機制,旨在為AF臨床治療提供新的治療思路。

1 材料

1.1 實驗動物40只SD大鼠,體質(zhì)量(220±20)g,動物來源:北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019-0009。實驗前所有大鼠在相同飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為:溫度20～24 ℃,濕度(50±10)%,12 h明暗交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)期間大鼠可自由進食和飲水。本實驗符合南陽市中心醫(yī)院動物實驗倫理批準(zhǔn),批準(zhǔn)號:NYZX-KY-2021123。

1.2 藥品與試劑自擬五倍子湯(由五倍子20 g,芒硝30 g,桑寄生30 g,荊芥30 g,蓮房30 g,大黃 20 g,明礬20 g,赤芍20 g,冰片10 g,枳殼20 g等中藥組成,采用高壓煎制而成,真空包裝,每包150 mL,由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供);高錳酸鉀(正大豐海藥業(yè)有限公司,批號:JS030516);腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6 ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:H052-1、H628、H037);兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(nuclear transcription factor-κB p65,NF-κB p65)多克隆抗體、兔抗大鼠環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)多克隆抗體及山羊抗兔二抗IgG(美國CST公司,貨號:4970、8242、13314、4413)。

1.3 儀器CFX Connect型熒光定量PCR(美國Bio-Rad公司);Hema9500型基因擴增儀(廣東黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司);LEICARM2245型石蠟切片機(德國徠卡公司)。

2 方法

2.1 AF大鼠模型的建立40只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機選取10只作為對照組,其余大鼠參考文獻方法建立AF大鼠模型[9],具體如下:將大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉后,觀察大鼠肛門狀態(tài),待肛門完全放松,以肛緣為界,手術(shù)刀切開表面皮膚組織直至直腸黏膜。將創(chuàng)面修剪為三角形缺損,深度達肛門括約肌,于傷口處引入紗布條,注入糞水2 mL,形成“開放、滲血、急性”的狀態(tài)。反復(fù)使用棉簽蘸取碘酒溶液擦拭創(chuàng)面,造成局部滲血模擬臨床換藥刺激,每日1次。造模48 h后觀察創(chuàng)面狀態(tài),如果有膿性分泌物,則表示傷口感染,模型建立成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、自擬五倍子湯組和陽性對照組,每組10只。自擬五倍子湯組大鼠使用自擬五倍子湯煎劑100 mL擦洗創(chuàng)面15 min,擦洗后給予常規(guī)包扎[10-11];陽性對照組大鼠使用高錳酸鉀稀釋液(1：5 000稀釋)100 mL擦洗創(chuàng)面15 min,擦洗后給予常規(guī)包扎;對照組及模型組給予等量生理鹽水擦洗創(chuàng)面,擦洗后給予常規(guī)包扎,每天1次,連續(xù)干預(yù)14 d。

2.2 疼痛行為學(xué)檢測實驗期間正常飲食飲水,給藥第1、7、14天干預(yù)后,比較各組大鼠的疼痛行為,記錄各組大鼠給予刺激后5 min內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù),包括大鼠腹部收緊、身體扭曲、后肢伸展和蠕動等行為;觀察并記錄大鼠首次舔舐肛周的潛伏時間和5 min內(nèi)舔舐肛周總時長。

2.3 炎癥因子水平檢測各組大鼠末次給藥后,禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,靜置4 h,3 000 r·min-1離心15 min,分離血清,-20 ℃ 保存。實驗時提前30 min取出血清樣品和ELISA試劑盒,按照TNF-α、IL-1β和 IL-6 ELISA試劑盒說明書要求操作。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)管、空白管和樣品管,分別于各管加入梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品、蒸餾水和樣品50 μL,充分混勻37 ℃水浴30 min,棄液拍干,各孔內(nèi)加入抗體工作液100 μL,37 ℃孵育 30 min,洗板拍干,加入顯色劑避光反應(yīng)20 min,終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀蒸餾水調(diào)零,測定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算待測樣品濃度。

2.4 HE染色觀察采血完畢后,頸椎脫臼處死大鼠,迅速分離大鼠肛門創(chuàng)面組織,生理鹽水沖洗,切取一部分創(chuàng)面組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h備用。將固定好的創(chuàng)面組織使用梯度濃度乙醇溶液脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。采用組織切片機將蠟塊切成5 μm的薄片,切片熱水中燙平,蓋上載玻片,烤箱烘干。蘇木精染色液浸染5 min,流水沖洗,鹽酸酒精分化10 s,流水沖洗,伊紅染液浸染 2 min,流水沖洗,再次脫水透明,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化。

2.5 RT-PCR檢測NF-κBp65mRNA、COX-2mRNA表達水平取部分創(chuàng)面組織,按照RNA提取試劑盒說明書操作,提取總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后保存?zhèn)溆?cDNA樣品稀釋10倍為模板,配制反應(yīng)混合液20 μL,其中TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL、Anchored Oligo(dT)18(0.5 g·L-1) 1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、總RNA 1 μg、ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,共進行35個循環(huán)。剔除誤差較大數(shù)據(jù),分析溶解曲線及擴增曲線,根據(jù)檢測結(jié)果以2-△△CT相對定量計算公式計算各樣品目的基因相對定量結(jié)果并進行分析,所有實驗重復(fù)3次取平均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達水平稱取適量各組大鼠創(chuàng)面組織,在冰上剪碎并勻漿裂解,加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液,勻漿至充分裂解。低溫離心,吸取上清液,BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白,12% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉搖床封閉2 h,分別加入以 1：2 000 比例稀釋的兔抗大鼠一抗NF-κB p65、COX-2和 β-actin抗體,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入以1：4 000比例稀釋的二抗,室溫下孵育2 h,TBST洗膜3次,滴加適量ECL發(fā)光試劑工作液,靜置1 min。凝膠分析系統(tǒng)采集圖像并分析,Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠5 min內(nèi)扭體反應(yīng)情況比較給藥第1、7、14天后,與模型組比較,自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠5 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)顯著減少(P<0.05)。與自擬五倍子湯組比較,陽性對照組大鼠 5 min 內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與給藥第1天后比較,給藥后第7、14天后自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠5 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)顯著減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠5 min內(nèi)扭體反應(yīng)情況比較 次)

3.2 各組大鼠首次舔舐肛周潛伏時間比較給藥第1、7、14天,與模型組比較,自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠首次舔舐肛周潛伏時間顯著增加(P<0.05)。與自擬五倍子湯組比較,陽性對照組大鼠首次舔舐肛周潛伏時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與給藥第1天后比較,給藥第7、14天后自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠首次舔舐肛周潛伏時間顯著增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠首次舔舐肛周潛伏時間比較

3.3 各自大鼠5 min內(nèi)舔舐肛周總時長比較給藥第1、7、14天后,與模型組比較,自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠5 min內(nèi)舔舐肛周總時長顯著減少(P<0.05)。與自擬五倍子湯組比較,陽性對照組大鼠5 min內(nèi)舔舐肛周總時長差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與給藥第1天后比較,給藥第7、14天后自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠5 min內(nèi)舔舐肛周總時長顯著減少(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠5 min內(nèi)舔舐肛周總時長比較

3.4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較與對照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低(P<0.05)。與自擬五倍子湯組比較,陽性對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

3.5 各組大鼠創(chuàng)面組織病理變化比較結(jié)果顯示,對照組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)完整,未見細胞腫脹、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。模型組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,細胞間存在大量滲出液,炎性細胞浸潤現(xiàn)象較嚴(yán)重。自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象均得到改善,胞間滲出液減少,炎性細胞浸潤現(xiàn)象明顯減少。見圖1。

注:A:對照組;B:模型組;C:自擬五倍子湯組;D:陽性對照組。圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織HE染色結(jié)果(×200,標(biāo)尺=50 μm)

3.6 各組大鼠創(chuàng)面組織NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA水平比較與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA 表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,自擬五倍子湯組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面組織NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。與五倍子湯組比較,陽性對照組大鼠創(chuàng)面組織NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 各組大鼠NF-κB p65 mRNA和COX-2 mRNA水平比較

3.7 各組大鼠創(chuàng)面組織NF-κB p65和COX-2蛋白表達水平比較與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織NF-κB p65和COX-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,五倍子湯組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面組織NF-κB p65和COX-2蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。與五倍子湯組比較,陽性對照組大鼠創(chuàng)面組織NF-κB p65和 COX-2 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表7、圖2。

注:A:對照組;B:模型組;C:自擬五倍子湯組;D:陽性對照組。圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織NF-κB p65和COX-2蛋白條帶圖

表7 各組大鼠NF-κB p65和COX-2蛋白表達水平比較

4 討論

中醫(yī)理論認為,AF患者多存在濕熱現(xiàn)象,濕熱下注于肛腸可導(dǎo)致周邊經(jīng)脈瘀滯,邪毒內(nèi)生,進而引起病理變化,產(chǎn)生潰爛[12-14]。臨床中采用的肛痿切除術(shù)、掛線術(shù)等方式,雖能將潰爛的組織切除,但無法治療內(nèi)里,清散體內(nèi)余毒。手術(shù)方式亦會使患者氣血受損、經(jīng)絡(luò)不通,使得濕熱瘀血難以隨經(jīng)絡(luò)行散而積蘊于肌膚,導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合,患者術(shù)后疼痛不已[15-17]。故需及時清熱解毒、散瘀化濁以抑制炎癥反應(yīng),促進創(chuàng)面愈合。因此,針對AF發(fā)病機制進行研究,開發(fā)新型治療方式,對提高AF患者生活質(zhì)量有著重大意義。

近年來,隨著對AF研究的深入,一些傳統(tǒng)中醫(yī)藥方在臨床治療AF中取得良好效用[18-20]。中醫(yī)藥指出,AF患者接受手術(shù)之后,受經(jīng)脈、肌肉斷裂影響,局部濕熱和血瘀現(xiàn)象較重,雖使用清熱祛瘀的藥方口服治療亦可達到治療效果,但起效較晚,難以消除患者早期疼痛之苦,故選用湯方直接作用于患處,療效更佳[21]。五倍子湯來源于《瘍科選粹》,在前人的基礎(chǔ)上,自擬五倍子湯方可有效清熱解毒,收斂效果較佳。故本研究建立AF大鼠模型,探討五倍子湯對AF大鼠術(shù)后鎮(zhèn)痛及炎癥反應(yīng)的影響,探究其可能作用機制。在本次研究中,自擬的五倍子湯中五倍子酸澀收斂,可止血、消腫止痛;芒硝有清熱、消腫止痛之用;大黃苦寒涼,可清熱止血、活血祛痕、瀉火解毒,外用能消腫、利濕止痛,三味藥共為君藥。方中明礬具有斂瘡消腫的作用,桑寄生可清熱除濕,荊芥可散風(fēng)熱、消瘡腫,蓮房可化癖止血,赤芍有涼血、散癖止痛的作用,冰片微寒,可消腫止痛。以上諸藥共為臣藥以奏清熱消腫活血止痛的功效。枳殼行氣消腫止痛,氣行則血行,為佐藥。全方偏苦咸寒,起到清熱解毒、行氣通絡(luò)、活血散癖、消腫止痛之功。結(jié)果顯示,模型組大鼠精神萎靡,進食量、飲水量明顯減少,創(chuàng)面滲液較多,創(chuàng)口愈合極為緩慢,提示模型組大鼠肛腸組織受到損傷,創(chuàng)面感染且伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。在觀察各組大鼠疼痛行為學(xué)中發(fā)現(xiàn),在給予自擬五倍子湯和陽性藥物干預(yù)后,自擬五倍子湯組和陽性對照組大鼠5 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)、5 min內(nèi)舔舐肛周總時長顯著減少,首次舔舐肛周潛伏時間則顯著增加。動物行為是直接反應(yīng)實驗對象當(dāng)下狀態(tài)的客觀指標(biāo),提示各實驗組大鼠術(shù)后疼痛現(xiàn)象明顯改善,自擬五倍子湯和陽性藥物可以有效促進大鼠術(shù)后創(chuàng)面的恢復(fù)。術(shù)后疼痛的病理學(xué)基礎(chǔ)是由炎癥因子持續(xù)刺激產(chǎn)生,在本研究中發(fā)現(xiàn),自擬五倍子湯組和陽性對照組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均呈降低趨勢,表明各組大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)得到抑制,疼痛現(xiàn)象也隨之減少。此外,在觀察創(chuàng)面組織切片時發(fā)現(xiàn),與模型組比較,各組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象均得到改善,胞間滲出液減少,炎性細胞浸潤現(xiàn)象明顯減少。進一步證實自擬五倍子湯可以減輕大鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng),改善大鼠術(shù)后疼痛現(xiàn)象。為驗證五倍子湯對AF大鼠的作用機制,將通過NF-κB p65信號通路探討其對術(shù)后疼痛和炎癥的作用機制。

NF-κB信號通路是典型的炎癥調(diào)控信號通路,組織在持續(xù)性的炎癥微環(huán)境暴露下,激活促炎細胞釋放大量炎癥因子,引發(fā)炎癥的聯(lián)級反應(yīng)[22-24]。在本研究中,模型組大鼠創(chuàng)面組織中NF-κB p65、COX-2 基因與蛋白水平均高度表達,結(jié)合大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平異常升高,提示模型組大鼠創(chuàng)面感染后,體內(nèi)NF-κB信號通路被激活。NF-κB作為啟動炎癥的關(guān)鍵因子,從與IκBs形成的復(fù)合物中解離進入細胞核,同時促進下游因子COX-2高度表達,COX-2是疼痛誘導(dǎo)階段的關(guān)鍵限速酶,在促炎因子的刺激下可以迅速表達于局部組織中,直接參與疼痛超敏反應(yīng)的生理過程[25-26]。在給予大鼠自擬五倍子湯和陽性藥物治療后,檢測各組大鼠NF-κB p65信號通路活性時發(fā)現(xiàn),NF-κB p65的蛋白表達活性受到了抑制。p65是NF-κB的一個亞基,是判斷炎癥反應(yīng)程度的標(biāo)志物,NF-κB p65活性受到抑制后,炎癥因子水平逐漸下降,相關(guān)COX-2基因與蛋白表達水平也逐漸恢復(fù)低水平狀態(tài),疼痛反應(yīng)受到抑制[23,27-28]。根據(jù)以上研究結(jié)果推測,自擬五倍子湯能夠抑制AF大鼠纖維化過程和炎癥反應(yīng),可能是與NF-κB p65/TGF-β1信號通路有關(guān)。

綜上所述,自擬五倍子湯能夠改善AF大鼠血清中炎癥因子水平,在一定程度上抑制術(shù)后疼痛反應(yīng),可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB p65信號通路發(fā)揮作用,為臨床治療AF提供實驗依據(jù)。