Box-Behnken響應面法優化地黃酵素的制備工藝及質量評價*

何江龍,牟文榮,張童童,紀寶玉,3,裴莉昕

1.河南中醫藥大學藥學院,河南 鄭州 450046; 2.河南省道地藥材生態種植工程技術研究中心,河南 鄭州 450046;3.天津大學藥物科學與技術學院,天津 300072

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根,具有清熱涼血、滋陰生津等功效,其化學成分主要含有環烯醚萜類、三萜類、木脂素類、黃酮類、酚酸類等[1]。地黃道地產區為河南焦作(古懷慶府),是著名的“四大懷藥”之一,也是六味地黃丸等諸多中成藥的要藥。地黃的炮制品被收錄于藥品及保健品目錄中,地黃相關的保健品、功能食品等較多,但地黃酵素等生物發酵制品的研究少見,以地黃為原材料,通過酵母菌和乳酸菌的雙重發酵制作酵素不但能夠解決新鮮地黃不易貯存的問題,還能縮短發酵時間提升口感[2-3],同時作為一種新型飲片的新興態勢,具有一定的研究意義和實用價值。

傳統酵素中含有豐富的多糖、酚酸、氨基酸、蛋白質等活性成分,在醫療保健中應用廣泛[4-5]。呂明珊等[6]、李相禹等[7]以總酚酸為指標,以桑葚、獼猴桃為原料進行響應面分析得到桑葚和獼猴桃的最佳發酵工藝條件。地黃中所含的酚酸是一類含有酚環的有機酸,是廣泛存在于自然界生物體內的天然功能性高分子化合物[8],具有極強的自由基清除能力和抗氧化功能[9-10],可延緩機體衰老、預防心血管疾病,具有抗炎、抗腫瘤、抗潰瘍等功效[11-12]。

本文以四大懷藥中的地黃為原料,在單因素實驗基礎上,通過研究地黃酵素發酵過程中多酚含量的變化,對影響制備地黃酵素工藝的各因素進行Box-Behnken實驗設計和響應面優化,以期獲得地黃酵素發酵的最佳工藝,為新型中藥制劑地黃酵素的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑實驗材料采集于河南省焦作市沁陽陳莊村,經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為玄參科植物地黃的新鮮塊根;酵母菌:安琪酵母股份有限公司;嗜酸乳桿菌:北京北納創聯生物技術研究院;MRS瓊脂、MRS肉湯、YPD液體培養基、蔗糖:北京索萊寶科技有限公司。沒食子酸標準品、葡萄糖標準品:上海源葉生物科技有限公司;福林酚、茚三酮、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3:麥克林生物科技有限公司;乙腈、甲醇、磷酸:賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備潔凈工作臺SW-CJ-1FD(蘇州安泰空氣技術有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋 KG-AP40M(KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC);電子分析天平 FA2004N-01156(上海民橋精密科學儀器有限公司);高速冷凍離心機JW-3021HR(安徽嘉文儀器裝備有限公司);精密臺式pH計FE28(海梅特勒-托利多儀器有限公司);多功能微孔板讀數儀VLBL0TD0(河南德信匯儀器設備有限公司)、高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.3 測量方法

1.3.1 地黃酵素中總酚酸的含量測定采用Folin-Ciocalteu法測定地黃酵素多酚的含量[13-14],繪制沒食子酸標準曲線。沒食子酸的濃度C (mg·L-1)與吸光值A的標準線性方程是y=0.005 6x+0.063 6,R2=0.999 0。結果表明沒食子酸標準溶液吸光度與其濃度在0～100 mg·L-1存在較好的線性關系。取0.10 mL地黃酵素液至1.5 mL試管中,加入10%的福林酚溶液0.50 mL,6 min后加入0.40 mL的7.5%Na2CO3,避光保存40 min后,于765 nm波長處測試樣吸光值,每只試樣重復3次,統計平均值,并根據回歸曲線計算發酵液中的總酚酸含量。

1.3.2 地黃酵素pH值的測定參照GB-10468-1989方法對地黃酵素樣品上清液進行檢測,每個樣品重復3次,計算平均值。檢測前,在25 ℃下將酸度計用pH 4.00、6.86、9.18的標準緩沖液進行校準。

1.3.3 地黃酵素中梓醇、地黃苷D的含量測定參考李洵等[15]采用HPLC多成分同時測定的方案,略做修繕,對地黃酵素中的梓醇及地黃苷D進行含量測定,并繪制標準曲線。梓醇的濃度C(mg·L-1)和吸光值A的標準線性方程為y=11 949x+1523.9,R2=0.999 5,結果表明,梓醇標準溶液的吸光度在75～2 400 mg·L-1范圍內與濃度呈良好的線性關系;地黃苷D的濃度C(mg·L-1)和吸光值A的標準線性方程為y=9 901.7x-0.286 7,R2=0.999 9,結果表明,梓醇標準溶液的吸光度在7.5～300.0 mg·L-1范圍內與濃度呈良好的線性關系。取地黃酵素液臨用前用0.22 μm微孔濾膜過濾,測量樣品的吸光值,每個樣品重復3次,計算平均值,并根據回歸曲線計算發酵液中的相對物質含量。

1.3.4 地黃酵素中還原糖的含量測定采用DNS法對地黃酵素還原糖的含量進行測定[16-17],并繪制葡萄糖標準曲線。葡萄糖的濃度C (mg·L-1)與吸光值A的標準線性方程是y=1.028 6x-0.005 2,R2=0.9992。結果表明葡萄糖標準溶液吸光度與80～720 mg·L-1之間存在較好的線性關系。取地黃酵素液0.10 mL,加入DNS試劑0.20 mL 混勻,沸水水浴5 min,顯色后冷卻至室溫,加蒸餾水至 4 mL,于540 nm波長處測試樣品吸光度,每只樣品重復3次,取平均值,并根據回歸方程計算發酵液中的還原糖含量。

1.4 實驗方法

1.4.1 地黃酵素工藝流程新鮮地黃→切片烘干→打粉過篩→加水→超聲→滅菌→(菌種→活化→擴大培養)接菌發酵→終止發酵→貯藏。

1.4.2 操作要點(1) 菌種活化及培養。在YPD液體培養基和MRS液體培養基分別接種上酵母菌和乳酸菌,封口后在搖床內28 ℃、160 r·min-1條件下培養酵母菌,在37 ℃,100 r·min-1條件下培養乳酸菌,使菌株到達對數生長期。(2) 地黃酵素的制備。選取地黃供試材料,洗凈切片,烘干粉碎,過三號篩,加入適量蔗糖,調整糖度,加入40 mL水,超聲30 min后,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,以1：3的比例接種活化好的酵母菌、乳酸菌液,130 r·min-1、37 ℃條件下恒溫培養48 h,制備地黃發酵液。

1.4.3 單因素實驗以料液比(1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50)、發酵時間(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h)、初糖量(0.0 g、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g)、發酵溫度(28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃)、酵母菌同乳酸菌接菌比例(2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5)為單因素進行實驗。見表1。

1.4.4 Box-Behnken響應面分析采用Design-Expert 11軟件展開響應面實驗設計。以-1,0,1代表自變量水平,以地黃發酵總酚酸含量為響應面值進行優化處理,進行方差分析。

2 結果

2.1 單因素實驗

2.1.1 初糖量對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響在發酵過程中,蔗糖為微生物生長提供碳源,地黃粉含有氨基酸和蛋白質為微生物生長提供氮源。在氮源和碳源適宜的條件下,微生物生長繁殖速度會大大提高,從而使代謝產物增加[18]。隨著初糖量的增加,pH值呈現先減小后增加趨勢,總酚酸含量呈現先增加后減小趨勢。此現象可能由于氮源不足從而導致微生物代謝發生了改變。在初糖量為0.4 g時,pH值達到最低點5.11,總酚酸含量達到最高點53.09 mg·L-1,因此認為最佳初糖量在 0.4 g 左右。見圖1。

圖1 初糖量對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.2 接菌比例對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響酵母菌與乳酸菌作為傳統發酵劑,在發酵過程中主要有共生與拮抗兩種關系,直接影響著發酵液的質量。通過調整接菌比例,一方面使發酵原料充分利用,另一方面獲得更理想的發酵產物[19]。隨著接菌比例增加,pH值呈現先增加后減小再增加趨勢,總酚酸含量呈現先增加后減小趨勢。此現象可能由于在不同發酵階段,由于酵母菌與乳酸菌拮抗和共生關系不同,從而導致代謝產物產生差異。在接菌比例為1：3時,pH達到最低值4.72,總酚酸含量達到最高值為64.29 mg·L-1,因此認為最佳接菌比例在1：3(酵母菌：乳酸菌=1：3)左右。見圖2。

圖2 接菌比例對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.3 發酵時間對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響當發酵時間較短,原料沒有被充分利用。當發酵時間過長,微生物逐漸衰亡,導致雜菌生長,從而影響最終代謝產物[20]。隨著時間增加,pH值呈現先降低再升高后降低的趨勢,總酚酸含量呈現先升高再降低的趨勢。此現象可能是由于發酵時間過長,導致微生物逐漸死亡,雜菌生長。當發酵時間在96 h時,pH達到最低值4.05,總酚酸含量達到最高值110.23 mg·L-1,因此認為最佳發酵時間應該在96 h左右。見圖3。

圖3 發酵時間對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.4 發酵溫度對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響發酵過程中,隨著溫度不斷增加,pH值呈現先降低然后逐漸升高趨勢,總酚酸含量呈現先升高后降低趨勢。此現象可能由于較低的發酵溫度可以抑制地黃酵素液中酶的活性從而減緩代謝的速度,過高的溫度也會影響酶的活性與微生物生長,甚至使酶失活[21],從而導致代謝產物減少甚至喪失。當發酵溫度在37 ℃時,pH達到最低值4.16,總酚酸含量達到最高值75.22 mg·L-1,因此認為最佳發酵溫度應該在37 ℃。見圖4。

圖4 發酵溫度對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.5 料液比對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響地黃發酵隨著料液比的增加,其總酚酸含量逐漸降低,其發酵后的pH值呈現先下降后升高的趨勢,當料液比為1：40時其pH值最低為4.64,原因可能是料液比過低時,地黃溶液濃度過高,不利于乳酸菌和酵母菌的發酵,從而使地黃酵素中pH值下降較慢,料液比過高時,地黃溶液濃度過低,使得酵素中的酚酸含量被稀釋[22],從而使pH值升高。因此料液比選在1：40左右較為合適。見圖5。

圖5 料液比對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.2 Box-Behnken響應面實驗結果與分析

表2 Box-Behnken響應面實驗設計與結果

2.2.2 模型方差分析利用Design-Expert 11軟件建立總酚酸含量的多元二次回歸響應面模型,通過多元線性回歸和二項擬合對實驗結果進行分析,驗證回歸模型與因素的顯著性。建立的回歸模型中F值為13.88,P值<0.000 1,表明本實驗建立的回歸模型的差異極顯著;失擬項P值為0.010 7<0.05,同樣可以說明模型差異顯著。一次項中初糖量(A)和發酵溫度(D)對總酚酸含量的影響較顯著,接菌比例(B)與發酵時間(C)的影響不顯著;二次項中A2、B2和C2對總酚酸的影響均不顯著,D2對總酚酸含量的影響極顯著;交互項中AB、AC、BC、AD、CD、BD對總酚酸含量的影響均不顯著。將表3中F值的大小進行比較可得出結論:4個因素對總酚酸含量的影響程度大小為發酵溫度(D)>初糖量(A)>接菌比例(B)>發酵時間(C)。見表3。

表3 方差分析

2.2.3 各因素交互作用的響應面與等高線結果分析響應面圖可以直觀地反映出兩變量對因變量的影響程度,曲面坡度愈陡,實驗時因變量對響應值的影響程度愈大,而當曲面坡度較小時,則說明實驗中因變量對響應值的影響很小;等高線圖越趨向橢圓,表明兩變量之間的交互作用越顯著,等高線圖越趨向圓形,則代表兩變量之間的交互作用越小[23]。根據響應面回歸模型所建立的初糖量(A)、接菌比例(B)、發酵時間(C)、發酵溫度(D)的交互效應響應面圖及等高線圖見圖6。

圖6 交互效應響應面圖及等高線圖

在固定因素發酵時間(C)與發酵溫度(D)的情況下,隨著初糖量(A)的增加,總酚酸含量呈現遞增趨勢;隨著接菌比例(B)增加,總酚酸含量呈現先增加后減小趨勢。在初糖量為0.45～0.50 g,接菌比例為2.0～2.5時,總酚酸含量在較高范圍內。固定接菌比例(B)與發酵溫度(D),隨著發酵時間(C)不斷增加,總酚酸含量呈現出先增加后減少的趨勢;隨著初糖量(A)增加,總酚酸含量呈現增加趨勢。在發酵時間為84～90 h,初糖量為0.45～0.50 g時,總酚酸含量處于較高水平。在固定接菌比例(B)與發酵時間(C)的情況下,隨著發酵溫度(D)的增加,總酚酸含量呈現先增加后減少的趨勢;隨著初糖量(A)增加,總酚酸含量呈現增加趨勢。發酵溫度為34～36 ℃,初糖量為0.45～0.50 g時,總酚酸含量較高。固定初糖量(A)與發酵溫度(D),隨著發酵時間(C)與接菌比例(B)不斷增加,總酚酸含量呈現先增加后減小的趨勢。發酵時間為84～90 h,接菌比例為2.0～2.5時,總酚酸含量在較高范圍。在固定初糖量(A)與發酵時間(C)的情況下,隨著接菌比例(B)和發酵溫度(D)的增加,總酚酸含量呈現先增加后減少趨勢。在接菌比例為2.0～2.5,發酵溫度為34～36 ℃時,總酚酸處于較高水平。在固定接菌比例(B)和初糖量(A)的情況下,隨著發酵時間(C)和發酵溫度(D)的增加,總酚酸含量呈現先增加后減少趨勢。當發酵溫度為34～36 ℃,發酵時間為84～90 h時,總酚酸含量處于較高水平。

2.2.4 驗證性實驗結果與分析對回歸擬合方程進行求解,得出總酚酸含量最高時最佳條件:A=0.499 0 g,B=2.284：1,C=85.97 h,D=35.107 ℃此條件下,預測最佳總酚酸含量為81.677 mg·L-1。根據實驗和實際操作可行性,調整后的地黃酵素制備工藝條件為:初糖量為0.499 0 g,接菌比例為 2.280：1(即乳酸菌比酵母菌為456 μL：200 μL),發酵溫度為35.1 ℃,發酵時間為86 h。采用優化后的工藝制備地黃酵素進行驗證性實驗,得到驗證性實驗結果為:總酚酸含量為83.165 mg·L-1,預期總酚酸含量為81.766 mg·L-1,同模型預測相對誤差僅為1.71%,說明響應面法對地黃酵素制備工藝優化的參數較為準確可靠,具有一定應用的價值性。

2.3 地黃酵素的品質分析

2.3.1 地黃酵素中梓醇、地黃苷D的含量通過酵母菌和乳酸菌對地黃進行發酵制得的地黃酵素,其梓醇含量為2.170%,地黃苷D含量為0.466%;參照2020版《中華人民共和國藥典》地黃中梓醇含量不少于0.20%,地黃苷D含量不少于0.10%的規定,此方法制得的地黃酵素符合要求。何偉等[24]、羅盟錡等[25]、劉秋瑾等[26]對靈芝、甘草、黃芪、板藍根進行發酵研究,均有新的發現,可為下一步地黃新型飲片的開發提供較好的參考和實際的數據支撐。同時,目前利用微生物發酵中藥是中藥研發的新途徑,在此基礎上,還可拓展其在食品、保健品行業等更多領域的應用范圍,具備很好的開發價值。

2.3.2 地黃酵素總酚酸含量對地黃液和地黃酵素進行總酚酸含量測定結果顯示,地黃液總酚酸含量為62.904 mg·L-1,發酵后地黃酵素總酚酸含量為83.165 mg·L-1,相對發酵前總酚酸含量提升了32.2%,這同易媛等[27]、周偏等[28]和高振鵬等[29]對桑葚酵素、諾麗酵素和蘋果酵素中酚酸含量測定的結果一致,發酵后總酚酸含量增加,分析原因可能是微生物可以將共價鍵結合的酚酸物質降解為小分子酚酸物質,也可能是微生物使地黃中的生物活性物質進行代謝,產生了新的酚類化合物,導致總酚酸含量升高。總酚酸具有抗氧化、防腐等作用,常作為抗氧化劑、殺菌劑應用于果蔬保鮮,其含量的增高可使地黃酵素更易貯藏。

2.3.3 地黃酵素還原糖含量對地黃液和地黃酵素進行還原糖含量測定結果顯示,地黃液還原糖含量為376.76 mg·L-1,地黃酵素液還原糖含量為614.25 mg·L-1,比發酵前提高了63.03%;地黃經發酵后還原糖含量增加。在此之前,易媛等[27]、劉磊等[30]和謝東東等[31]對桑葚、米糠以及不同水果進行發酵,研究發現還原糖含量呈不斷下降的趨勢;在胡蘿卜汁發酵的研究中發現多糖含量增加,還原糖含量降低,這同地黃發酵的結果相反,原因可能是發酵過程中糖類物質被微生物不斷降解利用,導致還原糖含量不斷下降;也可能其在發酵過程中合成果糖基轉移酶,使單糖主要轉化為多糖,導致還原糖含量降低[32-33]。本實驗地黃經發酵后還原糖含量增加,分析原因可能是不同微生物對多糖的降解效果存在顯著差異[34],也可能是由于地黃中的多糖含量較多,酵母菌和乳酸菌對地黃多糖進行降解,其代謝產生的各種消化酶能將多糖分解為小分子還原糖[31],最終導致還原糖含量增加。地黃還原糖具有補氣血的作用,且在地黃炮制后含量變化最為顯著,其含量的增高說明對地黃進行發酵處理制作酵素新型飲片具備可行性。

3 結論

筆者以“四大懷藥”中的地黃為原料,用酵母菌和乳酸菌進行發酵制備地黃酵素。在單因素實驗的基礎上進行了4因素3水平的響應面實驗,得出各因素對地黃酵素總酚酸含量的影響從高到低為發酵溫度>初糖量>接菌比例>發酵時間。考慮實驗的實際性和可操作性,將地黃酵素最優工藝參數調整為液料比40 mL：1 g、初糖量0.499 0 g、乳酸菌和酵母菌接菌比例為2.280：1、發酵時間為86 h、發酵溫度為35.1 ℃。在此條件下地黃經發酵后,pH值由6.19降至4.33,總酚酸含量由62.904 mg·L-1升至83.165 mg·L-1,相對發酵前總酚酸含量提升了32.2%;還原糖含量由376.76 mg·L-1升至 614.25 mg·L-1,相對于發酵前還原糖含量提高了63.03%;且梓醇、地黃苷D含量均符合2020版《中華人民共和國藥典》的要求。地黃酵素含有較高的酚酸類物質和還原糖,作為一種酵素飲品可以很好地滿足人們對營養的需求;含有的梓醇、地黃苷D含量符合藥用地黃標準,作為一種新型中藥制劑可以很好地滿足臨床用藥的需求。本實驗結果可為規模化制備地黃酵素提供一定的參考,更優化的制備工藝及總酚酸的理化性質均有待進一步的深入研究。