澳洲堅果莖段組織培養研究

農成銀 許光德 劉正魯 岑湘濤 沈 偉 牛俊樂

（百色學院農業與食品工程學院，廣西百色 533000）

澳洲堅果（Macadamia integrifolia &Macadamiate Trapbylla）為山龍眼科澳洲堅果屬，原產于亞熱帶，1940年被定為夏威夷經濟作物，因此又稱“夏威夷果”[1]。因營養成分豐富，香味獨特、質地細膩，備受國際市場青睞，有“堅果之王”的美譽。截至2022年，我國澳洲堅果種植面積達30 萬hm2[2]。

生產中澳洲堅果的主要繁殖方式分為種子實生苗繁殖、嫁接、扦插、壓條4 種。種子實生苗繁殖存在生長周期長、易發生變異、遺傳穩定性差等問題[3]。目前生產中多采用嫁接繁殖方式，但木本果樹枝干質地硬、皮薄，且單寧含量高，常規嫁接成活率一般在50%～80%[4]。扦插和壓條方式下根系的形成需較長時間，同時樹種也需要人工輔助管理，成本較高，生產上未得到廣泛推廣。植物組織培養技術是根據植物細胞的全能性，利用組織、器官、細胞等培育獲得完整植株，在保持母株優良性狀的基礎上，還具有生長周期短、繁殖率高、管理方便、有利于工廠化生產和自動化控制等優點。蘋果、櫻桃、桑葚等果樹利用組織培養技術，通過器官發生、叢生芽繁殖、體細胞胚胎發生等方式均可獲得優良穩定的組培苗木[5-7]。

本研究以澳洲堅果品種‘桂熱1號’帶芽莖段為外植體，探究適宜莖段外植體腋芽萌動的滅菌時間、腋芽萌發生長適宜的培養基種類，以期在短時間內培育出遺傳性狀穩定的優質無菌芽，為澳洲堅果組培快繁提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為澳洲堅果‘桂熱1號’健壯嫩枝，采摘于農業與食品工程學院苗圃。采摘活動于3～5個晴天午后進行，將采摘的外植體修剪為長度3 cm左右帶1～2個腋芽的莖段備用。

1.2 培養條件

培養溫度為（26±1）℃，光照度為2 000 lx、12 h/d。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體滅菌 將外植體沖洗干凈后用洗衣粉水浸泡15 min，沖洗干凈后再用0.1%的高錳酸鉀浸泡10 min，自來水沖洗干凈備用。將外植體放入無菌瓶用75%乙醇浸泡30 s 后倒出，用無菌水漂洗2～3 遍，再將外植體放進另一個新的無菌瓶倒入0.2%氯化汞表面消毒6、7、8、9、10、11、12 min，倒出0.2%氯化汞后用無菌水漂洗2～3遍，再用無菌吸水紙吸干水分后接種到以MS為基本培養基添加2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培養基上，7 d統計污染率，15 d統計腋芽萌動率。污染率和腋芽萌動率計算公式：污染率（%）＝（污染數/接種數）×100；腋芽萌動率（%）＝（接種未污染腋芽萌動數/接種數）×100。

1.3.2 腋芽萌發生長培養 將在最佳滅菌時間滅菌后的外植體分別接種在以MS 為基本培養基添加6-BA（1.0、2.0 mg/L）配合NAA（0.1、0.5、1.0 mg/L）或GA3（0.1、0.5、1.0 mg/L）的培養基上進行腋芽萌發生長培養。45 d統計腋芽萌發率及長勢。萌芽率計算公式：萌芽率（%）＝（接種未污腋芽萌發數/接種數）×100。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌

據表1 可知，在75%乙醇浸泡30 s 配合0.2%氯化汞溶液進行滅菌的條件下，隨著滅菌時間的增加，污染率從最高的65.00%逐漸降低到最低的8.69%，但腋芽無膨大萌動趨勢；芽萌動率先從30.00%升高到57.70%，隨著滅菌時間的延長降低到4.35%。試驗結果表明，75%乙醇配合0.2%氯化汞對澳洲堅果品種‘桂熱1號’莖段滅菌的最佳時間是9 min，此時污染率是26.92%，腋芽萌動率是57.7%，腋芽膨大明顯。

表1 0.2%氯化汞不同滅菌時間對莖段污染率及腋芽萌動率的影響

2.2 腋芽萌發生長

據表2 可知，在培養基為6-BA（1.0、2.0 mg/L）、NAA（0.1、0.5、1.0 mg/L）情況下，各個培養基的萌芽率都在50%左右，腋芽在培養基為6-BA（2.0 mg/L）配合NAA（0.5 mg/L）時長勢最好。接種10 d左右外植體基部開始形成愈傷組織，愈傷組量隨著時間延長逐漸增多，其中NAA（1.0 mg/L）培養基愈傷組量最多，基本覆蓋住腋芽，開始時呈顆粒狀乳白色，質地緊實，60 d 部分愈傷組織呈翠綠色。在6-BA（1.0、2.0 mg/L）、GA3（0.1、0.5、1.0 mg/L）培養基下的整體萌芽率稍低于6-BA 和NAA 組合的培養基，隨著GA3濃度增加，芽長勢逐漸減弱。形成的愈傷組織呈白色，質地相對松軟，量少。試驗結果表明，MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）適合澳洲堅果品種‘桂熱1號’無菌芽萌發生長。

表2 培養基種類對腋芽萌發生長的影響

3 結論與討論

3.1 外植體的滅菌

外植體的雜菌感染是植物組織培養過程中面臨的主要問題之一[8]。因此，外植體材料的滅菌是植物組織培養的一項重要工作。滅菌時間短會造成滅菌不徹底、污染嚴重的問題，滅菌時間過長又會導致外植體死亡、萌發延遲、分化率低等情況出現[9]。氯化汞是植物組織培養過程中外植體滅菌的常用滅菌劑，具有滅菌效果好、用量少的優點。75%乙醇與氯化汞組合是植物組織培養常用的一種滅菌方法。韓笑等[8]使用不同濃度的堿化乙醇和0.1%的氯化汞對金銀花莖尖進行滅菌處理，結果表明，用0.1%氯化汞浸泡7 min 滅菌效果最好，污染率降到8.3%。岑湘濤等[10]在杧果帶腋芽莖段滅菌的研究中發現，75%乙醇浸泡30 s配合0.1%氯化汞滅菌8 min效果最佳。于靜等[11]在單因素預實驗的基礎上，采用單一變量實驗設計，篩選出先用75%的乙醇消毒20 s，再配合0.1%的氯化汞溶液處理6 min是積雪草外植體最佳滅菌方法及時間。本試驗選用的75%乙醇浸泡30 s配合0.2%氯化汞處理9 min在澳洲堅果品種‘桂熱1 號’莖段滅菌中取得較好滅菌效果，與前人研究結果一致。

3.2 腋芽萌發生長

外植體分化的關鍵是植物生長調節劑的種類及濃度配比。常用的細胞分裂素包括6-BA、TDZ、KT等，常用的植物生長素有IAA、IBA、2，4-D、NAA[12-13]。生長素能夠促進節間的伸長和根的形成，而細胞分裂素可以使側芽從頂端優勢中解放出來。細胞分裂素能抑制生根，在生根培養基中通常除去細胞分裂素而加入一定濃度的生長素[14]。高濃度的細胞分裂素配合低濃度的生長素具有促進腋芽萌發和叢生芽分化的作用。GA3可以刺激器官生長，但是會抑制器官發生，抑制不定根的形成。肖祖飛等[15]研究表明，誘導1，8-桉葉油素型油樟莖段組織培萌芽最適培養基是MS+6-BA（1.0 mg/L）+IBA（0.05 mg/L），萌芽率73.33%。吳高殷等[16]以山杏莖尖和莖段為外植體，在對初代培養基激素配比的研究中發現，莖尖初代培養最佳激素配比為6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）；莖段初代培養最佳培養基激素配比為6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）。余志杰[17]研究發現，6-BA和NAA都是誘導牟平野生玫瑰莖段不定芽萌發和生長的主要因素，MS+6-BA（1.5 mg/L）+NAA（0.l mg/L）是誘導牟平野生玫瑰莖段不定芽發生的最佳培養基。郭麗[18]以單芽莖段為外植體研究鉆石海棠組織培養快繁體系的建立，結果表明：MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.l mg/L）為叢生芽最佳誘導培養基，誘導率60.7%。本研究篩選出適合澳洲堅果品種‘桂熱1號’腋芽萌發生長培養基配方是MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L），與前人研究結果相符。