PPOI調控葡萄生長發育的機制研究

李鎮江,楊志剛,唐曉芳,鄭又銘,陶繼文

(1.四川省食品發酵工業研究設計院有限公司,成都 611130;2.成都金開生物工程有限公司,成都 611130;3.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;4.四川農業大學生命科學學院,四川 雅安 625014)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界上最重要的栽培水果之一,作為一種典型的非躍變水果,其生長受內源性和外源性因素調控[1]。赤霉素、乙烯、脫落酸、細胞分裂素等內源性激素在葡萄的整個生命周期中發揮重要作用[2]。此外,多種生長調節劑如IBA、CPPU和TDZ[3],化合物如蔗糖[4],以及一些酶和轉錄因子都參與了葡萄的生長發育[5]。

PPOI是由好氧微生物利用糖類發酵產生的次級代謝產物,由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性等性質,常用作防腐劑、保鮮劑、殺蟲劑和抗菌劑等,被廣泛應用在醫藥、農業、食品及化妝品等行業[6]。有研究表明,外源施加一定濃度的PPOI可提高小麥種子的發芽率,促進小麥種子萌發及幼苗生長發育[7]。但目前關于施加外源PPOI促進葡萄生長發育,以及導致這種情況的分子機制尚不清楚,有關PPOI應用的研究報道主要集中在食品保鮮[8]、化妝品美白[9]以及相關的藥理作用方面[10],在農業促生方面的研究還較少。為了揭示PPOI處理促進“巨峰”葡萄生長發育調控機制,本研究用不同濃度的PPOI處理葡萄,并對其根系和葉片進行轉錄組分析,為更深入地研究PPOI促進生長發育機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗選用16株10年生的“巨峰”葡萄苗(四川農業大學生命科學學院提供),其中4株為對照組,12株作為處理組(2‰、4‰、8‰濃度PPOI)種植于高40cm×寬50cm的營養土中。在觀測到植物開始有發芽跡象時,開始添加PPOI,每棵植株2L處理液,對照組加入相同體積的自來水,待處理5次后,取生長速率最好的處理組及對照組的植株葉片和根系進行后續實驗,試驗發現4‰POOI促生效果最好,之后的實驗在此基礎上進行。(植株葉片：對照組(Lck)和處理組(L)各3個平行;植株根系：對照組(Rck)和處理組(R)各3個平行)。取完用液氮處理15min,放-80℃保存備用。

1.2 RNA提取和轉錄組測序

采用RNA提取試劑盒TRIzol Reagent提取葡萄根和葉總RNA,Agilent 2100 Bioanalyzer測定RNA濃度和純度;通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA,隨后通過離子打斷的方式將mRNA隨機打斷。構建cDNA文庫并進行質檢。將構建好的文庫在Illumina測序儀上進行PE150模式測序。測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.3 序列數據處理

使用FastQC v0.11.8對測序得到的原始數據進行質量檢查。過濾去除3′端帶接頭的序列;去除平均質量分數低于Q20的Reads。后續所有分析均是基于clean data進行的高質量分析。之后以歐洲葡萄“黑比諾”基因組作為參考基因組,使用利用HISAT2v2.0.5軟件將配對末端clean reads與參照基因組進行序列比對。

1.4 基因表達數據分析

采用FPKM對表達量進行標準化,使用DESeq軟件(1.20.0)進行PPOI處理根對照組(Rck)和處理組(R),葉對照組(Lck)和處理組(L)之間的差異表達分析。篩選差異表達基因條件為：表達差異倍數|log2FoldChange|>2,顯著性P-value<0.05。隨后對差異表達基因做GO和 KEGG富集分析。

1.5 差異基因蛋白網絡互作分析

依據STRING數據庫(https：//string-db.org/)進行蛋白互作分析,揭示目的基因之間的作用關系。

1.6 葡萄產量的測定

于果實成熟期統計單株果穗數后,每個處理(對照組和4‰PPOI處理組)選樹冠大小、生長勢相近的4株葡萄,每株在樹冠的東、南、西、北4個方向各取中等大小果穗2個,迅速運回實驗室測定各指標,每處理取樣各40 穗。用電子天平稱量單穗重并測定單產。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數據分析

通過Illumina NovaSeq平臺進行雙端測序,得到12個樣品的原始數據,對這些原始測序數據進行進一步過濾,除去帶接頭、低質量的Reads,原始數據,樣品的clean data百分比在93.44%～93.76%,均在93%以上。由此得出,測序數據質量已達要求,可以進行后續實驗。

2.2 表達差異分析

各組間表達量差異分析結果如圖1,施加PPOI后,根系中共有1658個基因顯著差異,其中有837個基因顯著上調;821個基因顯著下調(圖1a);葉片中共有463個基因顯著差異,其中有363個基因顯著上調;100個基因顯著下調(圖1b);基于表達量的聚類熱圖進一步證實了上述基因的差異表達情況(圖1c)。綜合結果表明,向根系施加PPOI能夠顯著引起根系的基因表達響應,且對葉片中的基因表達也有一定程度的影響。

圖1 外源施加PPOI后葡萄根系和葉片中的差異表達基因篩選

2.3 差異表達基因GO富集分析

GO富集分析表明,根中差異表達基因的分子功能主要富集在DNA結合的轉錄活性;細胞組分主要富集在細胞外周;生物學過程主要富集在轉錄調控-DNA模板和核酸模板轉錄調控等途徑(圖2a);葉片中差異表達基因的分子功能主要富集在DNA結合的轉錄活性;生物學功能主要富集在調節細胞代謝和轉錄調控-DNA模板化過程(圖2b)。綜合結論表明,無論是根還是葉片,施加PPOI后影響的主要過程是基因表達的轉錄調控過程。

圖2 外源施加PPOI后的GO功能富集和KEGG通路富集

2.4 差異表達基因KEGG富集分析

KEGG富集分析表明,根中差異表達基因主要參與了淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成、植物-病原體互作、MAPK信號轉導等途徑(圖2c);葉片中差異表達基因主要參與了半乳糖代謝、植物-病原體互作、內質網蛋白質加工、MAPK信號通路等途徑(圖2d)。

研究進一步對外源施加PPOI后的葡萄根系和葉片差異表達基因富集的植物激素—信號轉導通路進行分析?；诓町惐磉_基因中“植物激素-信號轉導”途徑的富集結果,列出了基因集中與“脫落酸信號”(3個)、“乙烯信號”(2個)、“磷酸化途徑”(1個)和“蛋白激酶”(3個)相關的基因及其功能預測信息(表1)。結果顯示,在根系施加PPOI后上述基因的表達模式均有顯著性改變。

表1 激素信號轉導途徑關鍵富集基因信息

2.5 關鍵轉錄因子挖掘

為了深入挖掘施加PPOI后葡萄根系和葉片中具有明顯響應的轉錄調控元件,對差異表達基因進行了轉錄因子預測(圖3)。

圖3 外源施加PPOI后葡萄根系和葉片差異表達轉錄因子篩選

葉片中顯著上調的轉錄因子中,ERF(16個,35.6%)、WRKY(7個,15.6%)、NAC(4個,8.9%)、MYB(3個,3.7%)類轉錄因子占比最大;根系顯著下調的轉錄因子中,MYB(3個,21.24%)、bHLH(2個,14.3%)、NAC(1個,7.1%)、NF-YB(1個,7.1%)、ERF(1個,7.1%)類轉錄因子占比最大(圖3 a)。

根系中顯著上調的轉錄因子中,ERF(24個,31.6%)、bHLH(6個,7.9%)、MYB(5個,6.6%)、bZIP(5個,6.6%)、NAC(4個,5.3%)類轉錄因子占比最大;葉片顯著下調的轉錄因子中,ERF(19個,16.8%)、MYB(12個,14.3%)、bHLH(11個,9.7%)、C2H2(10個,8.8%)、NAC(8個,7.1%)類轉錄因子占比最大(圖3 b)。

2.6 共表達網絡分析

利用皮爾森相關系數計算基因表達之間的關聯,并利用Cytoscape構建共表達網絡。輸入MYB、bHLH和ERF類轉錄因子共85個,苯丙烷代謝途徑、植物-病原體互作信號轉導途徑、淀粉-糖代謝途徑和光合作用相關基因共51個;生成249對正相關關聯基因對和37對負相關關聯基因對(圖4a)。表明PPOI響應下的轉錄因子主要通過正向調控途徑基因表達產生應答。轉錄調控網絡中,VvERF、VvMYB36、VvbHLH154、bHLH96是參與調控基因數量最多的轉錄因子;參與核苷酸代謝的核斑點RNA結合蛋白編碼基因VvRBP、參與糖類-淀粉代謝途徑的葡萄糖1磷酸腺苷基轉移酶編碼基因VvUDP、參與氧化應激響應的過氧化物酶編碼基因VvPOX是受到轉錄因子調控影響最大的代謝途徑關鍵基因(圖4a)。施加PPOI后多種轉錄因子共同作用增強植物生長發育與抗逆響應網絡,促進葡萄植株的生長發育(圖4b)。

圖4 外源施加PPOI后轉錄因子與關鍵途徑基因調控網網絡挖掘與潛在響應模式

2.7 產量的測定

對4‰PPOI施加后的“巨峰”葡萄與未施加進行產量測定,產量指標包括單穗重和單株穗數及單產。結果顯示,施加4‰PPOI能顯著提高“巨峰”葡萄單穗重和產量,但對單株穗數提高并不顯著,對單產提升約為15%左右(表2)。

表2 PPOI處理后巨峰葡萄產量變化

3 討論與結論

對施加4‰濃度PPOI處理的葡萄根系和葉片及處理組根系和葉片進行轉錄組測序分析,發現葡萄根系組織基因中共有1658個基因顯著差異,在葡萄葉片組織中共有463個基因顯著差異,表明PPOI激活了葡萄植株的代謝。

在GO功能分析中,差異表達基因主要富集在生物學過程中DNA轉錄調控,在分子功能中主要富集于轉錄活性及細胞代謝。KEGG富集分析中,參與淀粉和蔗糖代謝,半乳糖代謝、苯丙烷生物合成等代謝途徑的基因明顯上調。綜合GO和KEGG富集結果分析發現,PPOI能增強植株的轉錄調控以及物質代謝能力,從而發揮促生長的作用。

植物激素在調節植物生長發育和產質量發揮著重要的作用,有研究表明,植物的生長是多種激素相互作用的結果[11]。激素的代謝和信號傳導在決定細胞命運、影響轉錄組、影響蛋白質組、調節細胞周期等方面起著至關重要的作用[12]。本實驗中植物激素—信號轉導通路富集得到脫落酸信號、乙烯信號、磷酸化途徑和蛋白激酶相關基因,表明外源施加PPOI影響了葡萄生長發育激素的產生。從而多種激素共同作用促進葡萄植株的生長。

轉錄因子是參與真核生物基因表達的重要調控因子,對靶基因的轉錄活性具有激活/抑制作用[13]。本研究結合轉錄因子功能和代謝途徑富集分析結果推測,乙烯信號響應ERF類轉錄因子可能參與植物激素與發育調控;MYB、bHLH類轉錄因子介導苯丙烷-木質素途徑代謝調控,從而影響細胞壁發育;綜合多途徑基因表達調控共同影響葡萄植株在施加PPOI后的生長發育?；谏鲜鼋Y果,我們提出一個PPOI促進葡萄植株生長的模型假說：外源施加PPOI主要影響了葡萄根系和葉片中MYB、bHLH和ERF類轉錄因子的基因表達,進而調控下游核苷酸代謝(影響細胞增殖)、葉綠體相關基因(影響光合作用)和抗氧化途徑基因(影響植物抗逆)的表達。通過增強植物生長發育與抗逆響應網絡,共同促進葡萄植株的生長發育。