基于智能手機及機器學習技術對食品中多種抗生素的識別

鄧松泉，龔琪，唐艷秋，王楠，陳芳，朱麗華，王靖宇，王宏

華中科技大學化學與化工學院，武漢 430074

分析化學是利用各種手段獲得物質化學組成，測量各組成的含量，表征物質的化學結構、形態、能態，并在時空范疇跟蹤其變化的各種分析方法及其相關理論的一門科學，是化學中的信息科學。分析化學實驗旨在培養學生運用所學理論知識指導實驗并通過相關的實驗手段獲得分析對象組成和量等相關信息的能力。目前分析化學實驗主要培養學生熟悉測量原理及掌握相關實驗技能。隨著環境分析和生化分析等領域的發展，多目標分析物的識別與測定成為分析家們關注的重點。盡管通過分析儀器可獲得大量的測試數據，但從大量數據中合理解析有用信息，即“后儀器分析環節”——數據解析則成為多目標物分析的重要環節[1]。而目前高校開設的分析化學實驗中很少涉及多目標物分析和大量測試數據的解析，與環境分析等實際分析問題的需求尚有距離。因此培養學生掌握大量數據的解析能力并應用于多目標分析物測定具有重要意義。

比色分析和熒光分析作為一種快速、靈敏、廉價的檢測方法廣受關注。這兩類光學分析方法中光學探針的設計是關鍵。利用單一探針獲取多維信息，發展多目標物質的檢測方法有利于提升效率、實現儀器小型化。近年來，智能手機憑借其出色的光學鏡頭、豐富的色彩分析軟件、易于操作和便攜性、可提供現場測試和方便共享分析結果等優勢日益受到關注。在大量數據解析方面，人工智能中的機器學習方法可指導計算機自動學習輸入數據的數據結構和內在規律，有效地從多維數據中提取隱藏信息，實現準確的分類鑒別。在分析化學領域中，機器學習常用于信號和圖像處理，通過統計分析對數據進行解析，挖掘隱含信息從而實現對分析對象的分類等功能[2,3]。然而目前分析化學實驗很少涉及有關機器學習技術及利用智能手機作為數據獲取終端實現多目標物識別的實驗。

食品中抗生素殘留是食品安全中亟待解決的問題。四環素類抗生素(TCs)對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有廣泛的抗菌活性。由于其治療效果好、成本低、毒性低等優點被廣泛用于治療動物和人類感染[4,5]。此外，四環素類抗生素通常作為促進動物生長的飼料添加劑用于畜牧行業中[6]。抗生素殘留超標的食品如豬肉、蜂蜜、牛奶等可能導致嚴重的副作用，不同的抗生素引起的副作用各不相同。因此檢測食品抗生素殘留的種類及含量對于食品安全保障具有重要意義。

本實驗首先利用配位滴定指示劑鉻黑T (EBT)和銪離子(Eu3+)構建了比色熒光雙通道探針(EBT/Eu3+)。當在EBT/Eu3+中加入四環素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)及強力霉素(DOX)四種四環素(TCs)后，具有多羰基和羥基結構的TCs作為Eu3+天線效應配體[7]，與Eu3+結合后發射Eu3+特征熒光。同時，TCs可置換EBT/Eu3+配合物中的EBT，引起體系顏色變化。利用智能手機和熒光儀分別獲取顏色和熒光雙通道信息，借助機器學習中線性判別分析(LDA)，實現了對食品中四種TCs的識別。本實驗包含光學探針設計-測試數據獲取-測試數據解析的全流程，涵蓋了熒光探針設計、智能手機比色、人工智能、分析平臺搭建、線性判別分析方法等多個知識點，不僅可培養學生對海量分析量測數據的解析能力，還可以培養學生從單純的“數據提供者”向“問題解決者”的轉變。同時，本實驗所涉及的智能手機顏色識別、機器學習技術及食品安全等特色可極大提高學生學習興趣和積極性。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

1.1.1 EBT/Eu3+探針檢測TCs原理

圖1描述了鉻黑T (EBT)和銪離子(Eu3+)形成的探針(EBT/Eu3+)對四種TCs識別的原理。EBT在pH ＞ 6.3的溶液體系中呈藍色，與Eu3+結合后變為紅色。當加入DOX、CTC、OTC、TC四種TCs后，由于TCs與Eu3+結合能力強于EBT，能奪取EBT/Eu3+中的Eu3+，體系顏色發生變化。由于TCs與Eu3+結合能力隨TCs結構不同而異，因而加入不同結構的TCs后體系顏色不同，表現為RGB值差異。由于DOX、CTC、OTC、TC均含有二酮結構，可敏化Eu3+發出Eu3+的特征熒光，但其敏化效果因四種TCs結構而異，表現為EBT/Eu3+加入DOX、CTC、OTC、TC熒光強度不同。基于熒光信號和比色信號與TCs結構的相關性，利用此雙通道信號值，借助機器學習中的線性判別分析(LDA)可區分四種TCs。

圖1 EBT/Eu3+雙通道探針對四種TCs識別的原理

1.1.2 智能手機比色法原理

智能手機比色法是通過手機采集圖片，通過APP (Color Grab)直接獲取待測物的顏色空間參數，比較顏色色度而獲取待測組分濃度的一種分析手段。即首先通過智能手機拍攝顏色圖片，再用軟件將獲得的圖片顏色轉化為可以數值化的量。本實驗通過智能手機采集樣品的RGB數據來進行分析[8]。

1.1.3 線性判別分析法的實現

線性判別分析(LDA)是一種監督學習的降維技術，其主要原理為“投影后類內方差最小，類間方差最大”。即將同類型高維數據投影后，將同類型的高維數據聚類到低維空間，使相同類別之間相距較近，而不同類別之間相距較遠的一種分析方法[9]。本實驗通過應用OriginPro自帶的LDA功能進行線性判別分析。

1.2 試劑及材料

四環素(TC)、鹽酸土霉素(OTC)、鹽酸金霉素(CTC)、鹽酸強力霉素(DOX)、三羥甲基氨基固體(Tris)、鉻黑T (EBT)、六水合氯化銪(EuCl3·6H2O)、氯化鈣溶液(CaCl2)、氯化鉀溶液(KCl)、蔗糖溶液(SUC)、青霉素G鈉溶液(PG)、鏈霉素溶液(SM)、α-乳糖溶液(α-L)，以上試劑均為分析純，鹽酸(0.1 mol·L-1)，所用試劑均由國藥集團化學試劑有限公司提供。蜂蜜來源于當地超市。

1.3 儀器和表征方法

pH計(雷磁PHS-3C，上海儀電科學儀器股份有限公司)；渦旋振蕩器(LAB DANCER S25，IKA)；紫外-可見分光光度計(2700，日本島津)；熒光光譜儀(RF-5301PC，日本島津)；熒光分光光度計(FLS50，愛丁堡)；智能手機(帶有Color Grab軟件)；自制暗箱(帶蓋的泡沫盒，使用LED穩定光源)。

1.4 實驗步驟

1.4.1 實驗用溶液的配制

1) 四環素儲備液的配制。

稱取0.1227 g鹽酸四環素(TC)，用蒸餾水溶解、稀釋、轉移至50 mL容量瓶，配制得50 mL 0.005 mol·L-1的TC標準溶液。同理，分別稱取0.1175 g鹽酸土霉素(OTC)、0.1315 g 鹽酸金霉素(CTC)、0.1343 g 鹽酸強力霉素(DOX)，分別配制成50 mL 0.005 mol·L-1的OTC、CTC、DOX標準溶液，待用。

2) pH緩沖溶液的配制。

稱取1.2114 g三(羥甲基)氨基甲烷固體(Tris)，用蒸餾水溶解，稀釋，通過0.1 mol·L-1的鹽酸溶液調節體系的pH為7.0，定容至50 mL，即可得到pH = 7.0的Tris-HCl緩沖溶液(0.2 mol·L-1)。

3) EBT溶液的配制。

稱取0.0472 g EBT固體，用蒸餾水溶解、稀釋、定容至100.0 mL，得到1.00 mmol·L-1的儲備溶液，待用。

4) Eu3+標準溶液的配制。

稱取0.1870 g六水合氯化銪固體，用蒸餾水溶解、稀釋、轉移至50 mL容量瓶定容，得到50 mL 10 mmol·L-1的銪離子標準溶液，待用。

5) 干擾物質溶液配制。

分別稱取0.1110 g氯化鈣、0.0746 g氯化鉀、0.3423 g蔗糖、0.3423 gα-乳糖、0.3564 g青霉素G鈉、0.5816 g鏈霉素，用蒸餾水溶解、稀釋、轉移至100 mL容量瓶定容，得到100 mL 1 mmol·L-1的標準溶液，待用。

6) 待測樣品溶液的配制。

依次分別移取2.00 mL Tris-HCl緩沖溶液、200 μL EBT標準溶液、5 μL Eu3+標準溶液、10 μL TC標準溶液于三支10 mL離心管中，加蒸餾水定容至10.0 mL，得到三份TC/EBT/Eu3+的待測溶液。同理，分別配制OTC/EBT/Eu3+、CTC/EBT/Eu3+、DOX/EBT/Eu3+的標準待測溶液，每種樣品溶液平行配制三份。同時，移取2.00 mL Tris-HCl緩沖溶液、200 μL EBT標準溶液，加蒸餾水定容至10.0 mL，得到EBT溶液；移取2.00 mL Tris-HCl緩沖溶液、200 μL EBT標準溶液、5 μL Eu3+標準溶液，加蒸餾水定容至10.0 mL，得到EBT/Eu3+溶液。上述兩溶液將用于紫外-可見吸收光譜測試作為對照樣品。

依次移取4.00 mL Tris-HCl緩沖溶液、400 μL EBT標準溶液、10 μL Eu3+標準溶液、10 μL TC和10 μL OTC標準溶液于10 mL離心管中，加水定容至10.0 mL，平行三份。同理，分別配制TC/CTC/EBT/Eu3+、TC/DOX/EBT/Eu3+、OTC/CTC/EBT/Eu3+、OTC/DOX/EBT/Eu3+、CTC/DOX/EBT/Eu3+的標準待測溶液。

1.4.2 蜂蜜中TCs的區分及添加TCs的雙盲實驗

用渦流混合器將2.00 g市售蜂蜜與5.00 mL Tris-HCl溶液混合10 min，以4000 r·min-1離心30 min，取出后得蜂蜜溶液，靜置待用。依次移取蜂蜜溶液的上清液20 μL、2.00 mL Tris-HCl緩沖溶液、200 μL EBT標準溶液、5 μL Eu3+標準溶液、10 μL TC標準溶液于10 mL離心管中，加蒸餾水定容至10.0 mL，得到TC/蜂蜜/EBT/Eu3+待測溶液，平行配制三份。同理，分別配制OTC/蜂蜜/EBT/Eu3+、CTC/蜂蜜/EBT/Eu3+、DOX/蜂蜜/EBT/Eu3+的標準待測溶液。同時，依次移取蜂蜜溶液的上清液20 μL，2.00 mL Tris-HCl緩沖溶液，200 μL EBT標準溶液，5 μL Eu3+標準溶液于10 mL離心管中，加蒸餾水定容至10.0 mL，得到BLANK/蜂蜜/EBT/Eu3+待測溶液，即空白組，作為對照

由其他人員將10 μL 0.10 mmol·L-1的TC、OTC、CTC、DOX隨機加入到20 μL蜂蜜稀釋液中，編號為Unknown 1-4。其他操作與標準樣品相同。

1.4.3 重復性實驗

對前文所提配制的TCs/EBT/Eu3+的平行標準樣進行多次測定計算誤差以評價實驗的重復性。

1.4.4 選擇性實驗

依次分別移取2.00 mL Tris-HCl緩沖溶液、200 μL EBT標準溶液、5 μL Eu3+標準溶液至試管中，并分別加入10 μL的氯化鈣溶液、氯化鉀溶液、青霉素G鈉溶液、蔗糖溶液、鏈霉素溶液、α-乳糖溶液配制6份樣品進行后續測定。

1.4.5 紫外-可見吸收光譜測試

以蒸餾水作為參比，對樣品進行紫外-可見吸收光譜測試。掃描波長：200-800 nm。

1.4.6 熒光測試

激發波長為400 nm，發射波長為620 nm，激發和發射狹縫都為5 nm。

1.4.7 智能手機比色法測定樣品的RGB值

將進行熒光檢測后的樣品放入具有穩定光源的自制暗盒中，將智能手機固定在暗盒上。對同一樣品拍照三次，利用Color Grab軟件采集樣品的RGB值。

1.4.8 數據處理及LDA的實現

將所獲得的各樣品的RGB值及熒光強度值求平均值和標準偏差后導入OriginPro 2016，采用LDA線性分析得到區分圖。

2 結果與討論

2.1 EBT/Eu3+探針加入TCs后顏色及熒光變化

圖2a是不同樣品的吸收光譜。EBT作為一種金屬離子指示劑，在pH ＞ 6.3的溶液體系中呈藍色，在624 nm處有吸收峰(綠色曲線)，與Eu3+結合后形成配合物，吸收峰移動到533 nm (藍色曲線)，溶液呈紅色。TCs含有多羰基結構，能與金屬離子在不同條件下能形成1 : 1、1 : 2或2 : 1型配合物[10]。當EBT/Eu3+中加入TCs后，TCs奪取EBT/Eu3+配合物中Eu3+，533 nm處的吸收峰降低，624 nm處的吸收峰上升，伴隨著溶液的顏色由紅色又變成紫色。由于四種TCs與Eu3+結合能力不同導致四種溶液的A626nm/A533nm不同，表現出不同顏色，采用智能手機拍照后獲得的RGB值不同。

圖2b是不同樣品的熒光光譜。具有二酮類結構的TCs與Eu3+配位后，可將吸收的光傳遞給稀土離子，敏化稀土離子發光。由圖2b可知，在EBT/Eu3+體系中加入四種TCs后，EBT/Eu3+/TC和EBT/Eu3+/OTC體系在620 nm均發射出很強的Eu3+特征熒光。而EBT/Eu3+/CTC和EBT/Eu3+/DOX體系中620 nm的熒光峰很弱，這可能是CTC和DOX與Eu3+能量傳遞效率不高所致，不同結構的TCs引起體系熒光差異為TCs的識別提供了基礎。

2.2 EBT/Eu3+探針對一元TCs的識別

TCs加入EBT/Eu3+溶液后，體系的比色和熒光響應信號隨TCs結構而異，表明EBT/Eu3+對抗生素選擇性識別具有可行性。為了獲得最佳的識別效果。對體系條件進行了優化以獲得最佳的比色信號與熒光信號。研究發現當體系的激發波長為400 nm，pH為7.0，銪離子濃度為5 μmol·L-1，EBT濃度為20 μmol·L-1，反應時間為8 min時，可以獲得最佳的比色信號和熒光信號，同時有利于體系應用于蜂蜜等實際樣品的檢測[11]。

在所獲得的最佳條件下，采用智能手機和熒光光度計對四種TCs加入EBT/Eu3+后進行拍照和熒光測試獲得不同體系的熒光強度和RGB值，所得結果如圖3a所示。當加入的TCs濃度為5.0 μmol·L-1時，四種溶液的RGB值和熒光強度呈現明顯的差異，這是由于四種四環素與Eu3+結合能力和敏化效果不同所致。LDA作為一種分類識別方法已成為區分類似分析物的重要手段[12]。利用TCs加入EBT/Eu3+溶液后比色和熒光雙通道信號，借助LDA可以區分不同結構的四環素，采用OriginPro軟件處理數據(4種信號值 × 3個平行樣 × 4組樣)，得到LDA圖，結果如圖3b所示。LDA通過對帶標簽的點進行投影，建立不同樣品間分類差異，以保證組內距離最小而組間距離最大，使原始的多維數據處理為易區分與識別的二維數據。根據LDA特點可知，組間距離越遠則差異越大，圖3b中每個點代表每種TCs對EBT/Eu3+的響應，12個原始數據點明顯被分成4組，分別為TC、OTC、CTC和DOX，且每組的距離很遠，同一組內各點距離很近，表明TC、OTC、CTC和DOX能被有效區分。

圖3 (a) EBT/Eu3+溶液中四種TC的比色和熒光響應；(b) EBT/Eu3+傳感器陣列區分四種TCs的二維LDA圖

2.3 EBT/Eu3+探針對二元TCs的識別

為了探究EBT/Eu3能否識別兩種TCs混合物，從所實驗的四種TCs中任意選擇兩種進行1 : 1混合后獲得總濃度為10 μmol·L-1的二元混合物。將混合體系進行熒光測試和智能手機拍照獲取熒光強度和RGB值，結果見圖4a。由圖4a可知，六種混合體系的熒光強度和RGB值各不相同。圖4b是LDA結果，由圖可知，六種二元混合物距離較遠，沒有任何重疊，表明所有樣本中兩種抗生素可以完全分離，EBT/Eu3+雙通道探針具有分析復雜樣品的潛在能力。

圖4 (a) EBT/Eu3+溶液中二元標準樣品的比色和熒光響應；(b) 利用Eu3+/EBT區分不同的兩種TCs的混合物LDA圖

2.4 EBT/Eu3+探針區分蜂蜜樣品中TCs

為了評價EBT/Eu3+識別TCs在實際樣品中的應用，將四種濃度均為5.0 μmol·L-1的TCs加入到蜂蜜樣品中。按照前述方法進行比色與熒光測試，再進行LDA處理，所得結果如圖5。圖5a為蜂蜜樣品中加入不同TCs的熒光強度和RGB值，四組樣品和空白樣具有不同的熒光強度與RGB值。由圖5b可知四種TCs在蜂蜜樣品中也能被明顯分為4組，且4組樣品與空白樣品距離很遠。表明此方法在實際樣品中具有區分TCs的能力。

圖5 (a) 含EBT/Eu3+的蜂蜜樣品中加入不同TCs后的比色和熒光響應；(b) 利用Eu3+/EBT區分蜂蜜樣品中TCs的LDA圖

此外，為了驗證該方法識別未知樣品的可靠性，還根據上述訓練矩陣檢測4種未知的樣本。將4種濃度均為5.0 μmol·L-1的TCs由他人加入到蜂蜜樣品中制備成盲樣(Unknown 1-4)，采用上述同樣的方法進行了識別。由圖6可知，四個盲樣可以準確分類到相應的標準樣品類別，獲得100%識別準確度。這一結果表明所設計的雙通道傳感器陣列能夠識別未知的TCs樣品。

圖6 利用Eu3+/EBT區分蜂蜜中TCs盲樣的LDA圖

2.5 實驗的重復性

圖7展示了EBT/Eu3+雙通道傳感陣列對TCs分析的重復性結果，對樣品熒光以及RGB值均進行了三組平行測定。圖7a顯示了三次平行測定熒光強度所得的結果，由此可以看出實驗的重復性良好，圖7b顯示的RGB值平行測定的結果類似。由此可知，實驗的重復性良好。

圖7 EBT/Eu3+探針加入TCs后熒光強度(a)及RGB值(b)重復測試的結果

2.6 選擇性實驗

圖8展示了EBT/Eu3+雙通道傳感陣列對TCs選擇性識別的結果。選擇了6種可能干擾識別TCs的物質，包括Ca2+、K+、鏈霉素(SM)、青霉素G鈉(PG)、α-乳糖(α-L)、蔗糖(SUC)用于評價對TCs識別的影響。由圖8可知，除了TCs展示出高響應性外，這些干擾物質均無熒光發射(圖8a)。顏色系統值的響應也與TCs組別相去甚遠(圖8b)。圖8c是采用LDA方法處理后得到二維計分圖。四種TCs和干擾物明顯被區分為五個區域，且相互分離。這些結果表明，這些物質對EBT/Eu3+識別TCs沒有影響，即EBT/Eu3+雙通道陣列對檢測TCs具有良好的選擇性。

圖8 EBT/Eu3+雙通道傳感陣列對于TCs以及所選干擾物質的熒光強度(a)、比色響應(b)，以及LDA對該數據進行識別的結果(c)

3 結語

本文發展的方法不僅能夠成功實現四種一元四環素的定性識別，還能有效識別二元四環素混合物及蜂蜜中未知TCs樣品的識別，正確率達100%。本實驗涵蓋了分析化學與人工智能等多學科，有利于培養學生的綜合能力。利用指示劑與稀土離子制備雙通道探針以獲得不同信號，構思巧妙。使用普及率高的智能手機、熒光儀器和OriginPro軟件中的模式識別技術，推廣性好。同時本實驗的原料廉價易得，操作簡單，環境友好，重復性好，每人每次成本約為3.8元，教學時長約8-10 h，非常適合于本科生高年級的分析化學綜合實驗。