HPLC 法測(cè)定中藥材覆盆子中黃曲霉毒素的含量及安全性評(píng)價(jià)

鄭盈瑩，任琦，劉桂鳳，許妍

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

中藥材覆盆子的來源是薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥未成熟果實(shí)，果實(shí)在入夏初期顏色由綠色變綠黃色時(shí)及時(shí)采收，采收時(shí)間為4～5 月，產(chǎn)于浙江、江西等地［1-4］，加工方式為除去梗、葉等雜質(zhì)，放于沸水中短時(shí)間燙或蒸后，撈出，曬干或烘干，常見的炮制品有酒覆盆子、鹽覆盆子等［5］。覆盆子具有補(bǔ)益肝腎的功效，即可益腎固精縮尿，又能養(yǎng)肝明目，臨床上可治療肝腎功能不足引起的遺精滑精、陽痿早泄、遺尿尿頻、目暗昏花等癥，炮制后補(bǔ)腎益精功效增強(qiáng)，可以治療腎虛引起的遺尿尿頻、陽痿遺精滑精等癥；同時(shí)覆盆子還是不少經(jīng)典方劑的重要藥味，常見的經(jīng)方有五子衍宗丸、全鹿丸、鎖陽固精丸等，多數(shù)為補(bǔ)虛藥，服藥周期較長(zhǎng)，藥物的副作用和毒性易蓄積于患者體內(nèi)［6］。

黃曲霉毒素（以下均用縮寫AF 代替）是目前所知的毒性最強(qiáng)的真菌類次生毒素，具有很強(qiáng)的致癌性，同時(shí)具有慢性肝腎毒性。由于覆盆子藥材、炮制品及制劑的服用者相當(dāng)一部分肝腎功能不全，再加上服藥時(shí)間較長(zhǎng)，毒性進(jìn)一步蓄積，可能對(duì)肝腎造成不可逆的損傷［7-8］。本研究通過高效液相色譜法測(cè)定覆盆子中的AF 含量，對(duì)其藥材的真菌毒素污染情況進(jìn)行研究，以期為覆盆子藥材的安全性提供參考。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司），RF-20A 型熒光檢測(cè)器（日本島津公司），UVE 型光化學(xué)衍生化反應(yīng)器（LC Tech 公司），ML204 型電子天平（Mettle Toledo 公司），T25 高速分散機(jī)（IKA公司），ST16R 型低溫離心機(jī)（Thermo-Fisher 公司）。

1.2 試藥

AF 混合對(duì)照品溶液（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：610001-202006，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標(biāo)示濃度分別為1.04，0.38，1.08，0.38 μg/mL）；Afla StarTMR 免疫親和柱（ROMER，批號(hào):1000003007）；甲醇為色譜純，氯化鈉等其他試劑均為分析純；超純水為 Milli-Q Direct16 超純水儀制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell pak C18 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水（45∶55）；流速：0.6 mL/min；衍生器：光化學(xué)衍生化反應(yīng)器（λ=254 nm）；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：λex=360 nm，λem=450 nm。

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制

精密吸取AF 混合對(duì)照品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻后得到標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻后即得混合對(duì)照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2質(zhì)量濃度分別為2.08、0.76、2.16、0.76 ng/mL）。混合對(duì)照品溶液色譜圖見圖1。

圖1 AFM對(duì)照品HPLC圖譜

2.3 供試品溶液的提取制備

取供試品，粉碎，取能通過二號(hào)篩的粉末約15 g，精密稱定后加氯化鈉粉末3 g，混勻后精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min（攪拌速度20 000 r/min），離心5 min（離心速度4 000 r/min）后傾出上清液，精密量取15 mL 置50 mL 量瓶中，加水定容，搖勻后離心10 min（離心速度4 000 r/min），傾出上清液，精密量取20 mL 通過免疫親和柱，用20 mL 水凈化后抽干，最后用適量甲醇慢慢通過免疫親和柱（時(shí)間不少于1 min），甲醇液置2 mL量瓶中并定容，搖勻后用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。供試品溶液色譜圖見圖2。

圖2 供試品溶液HPLC圖譜

2.4 線性范圍

精密吸取混合對(duì)照品溶液5，10，15，20，25 μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定各成分峰面積，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），計(jì)算得到相應(yīng)成分的回歸方程，見表1。結(jié)果表明，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對(duì)照品在相應(yīng)的質(zhì)量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性回歸方程

2.5 儀器精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量均為10 μL，測(cè)定各相應(yīng)成分的峰面積，結(jié)果AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積RSD 分別為0.8%，0.6%，1.0%，0.6%，表明儀器的精密度良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

取不含AF 的樣品（樣品批號(hào)：202101），粉碎，取樣量約15 g，共9 份，分別與氯化鈉粉末3 g混合后，精密加入混合對(duì)照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2質(zhì)量濃度分別為0.020 8、0.007 6、0.021 6、0.007 6 ng/mL）20、30、50 mL 各3 份，再加70%甲醇溶液補(bǔ)至75 mL，按“2.2”項(xiàng)下的供試品制備方法可得低水平、中間水平和高水平回收率的供試溶液，進(jìn)樣25 μL 測(cè)定，結(jié)果見表2，可見方法準(zhǔn)確性良好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.7 檢出限與定量限

取不含AF 的樣品粉末（樣品批號(hào)：202101），精密加入一系列低濃度對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，分別測(cè)定，以3∶1、10∶1 的信噪比水平計(jì)算檢出限、定量限，結(jié)果AFB1、AFB2、AFG1、AFG2檢出限分別為0.03、0.01、0.03、0.01 μg/kg，定量限分別為0.10、0.03、0.10、0.03 μg/kg，可見方法靈敏度較高。

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果

對(duì)所收集的31 批樣品中FB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量進(jìn)行測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，結(jié)果均未檢出。

3 討論

此次實(shí)驗(yàn)共涉及31 批次樣品，其中25 批次來自市售隨機(jī)抽樣，涵蓋了成都荷花池中藥材市場(chǎng)、河北省安國(guó)藥材市場(chǎng)、安徽省亳州藥材批發(fā)市場(chǎng)及樟樹市中藥材批發(fā)市場(chǎng)；6 批次來自覆盆子藥材的產(chǎn)地收購(gòu)，采收時(shí)間涵蓋2019—2021 年，對(duì)于反映當(dāng)前覆盆子藥材的實(shí)際情況有較好的代表性。

3.1 覆盆子的安全性分析和評(píng)價(jià)

覆盆子是聚合果，每一顆果實(shí)都由許多小核果聚合而成，在采收時(shí)其中種子尚未完全成熟（見圖3），其采收時(shí)間為每年四月底至五月初，主產(chǎn)地為我國(guó)華南至華東地區(qū)，采收、干燥期間的溫濕度均十分適合黃曲霉毒素生長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)專門針對(duì)覆盆子的黃曲霉毒素污染情況進(jìn)行考察，結(jié)果均未檢出，說明覆盆子被黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)很低，可能與覆盆子中碳水化合物及油脂的含量較低有關(guān)［9］。

圖3 覆盆子（整體及瘦果）

3.2 色譜條件的考察

覆盆子富含黃酮類、鞣質(zhì)和有機(jī)酸［10-11］，對(duì)黃曲霉毒素的測(cè)定有一定的干擾，經(jīng)過對(duì)色譜條件進(jìn)行調(diào)整并最佳化［12-14］，流動(dòng)相調(diào)整為甲醇-水（45∶55），流速設(shè)為0.6 mL/min 時(shí)，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2能完全分離，峰形好，樣品無背景干擾。使用3 種不同品牌型號(hào)的色譜柱按此條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果4 種成分均分離良好，表明方法耐用性良好。由于供試品雜質(zhì)多，易污染色譜柱，造成之后的測(cè)定過程中背景干擾大，建議在樣品進(jìn)針后以高比例有機(jī)相沖洗色譜柱，以避免出現(xiàn)假陽性，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。