魚腸道中高產苯乳酸乳酸菌的篩選、鑒定及發酵條件優化

呂孟敏，白鳳翎，崔方超，檀茜倩，呂欣然*，勵建榮，2，郭曉華

（1.渤海大學 食品科學與工程學院 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心 遼寧省高等學校生鮮食品產業技術研究院，遼寧 錦州 121013；2.大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034；3.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276800）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）又稱為2-羥基-3-苯丙酸，含有一個手性碳原子，可以形成兩種對映體，即D-PLA和L-PLA，是一種具有廣譜抗菌活性的化合物[1-4]。多種微生物如乳酸桿菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）和白地霉（Geotrichum candidum）等都具有合成苯乳酸的能力[5-8]。其中，乳酸菌是公認的食品級安全（generally recognized as safe，GRAS）微生物，其可利用苯丙酮酸或苯丙氨酸為底物代謝產生苯乳酸，已成為微生物生產苯乳酸的優勢菌種，其合成的苯乳酸也被視為食品級安全的天然防腐劑[9-10]。

LAVERMICOCCA P等[11]首次從酸面團中篩選獲得一株產苯乳酸的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21B，苯乳酸產量為56 mg/L。隨后研究者們從多種環境來源的乳酸菌中篩選產苯乳酸菌株，STR?M K等[12]從草貯飼料中分離出一株高產苯乳酸的植物乳桿菌MiLAB393，苯乳酸產量為94 mg/L；劉長建等[13]從豬的消化系統中篩選得到24株能夠產苯乳酸的乳酸菌，其中分離自豬糞便的乳酸菌r16苯乳酸產量較高，達233.0 mg/L；李興峰等[14]從自然發酵泡菜中分離篩選出一株苯乳酸產量較高的乳酸菌，產量可達91 mg/L。但由于乳酸菌分離來源的不同，不同菌株間合成苯乳酸產量差異較大，且苯乳酸產量相對都較低[15]。因此，要實現乳酸菌工業化發酵生產苯乳酸，篩選高產苯乳酸的乳酸菌具有重要的研究價值和意義。

魚類腸道內微生物種類豐富，乳酸菌是其腸道內天然棲息的一種益生菌，但由于其生存環境獨特，其存在大量功能性菌株未被挖掘。因此，本研究通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定苯乳酸含量，從多種魚腸道來源的乳酸菌中篩選高產苯乳酸的菌株，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并通過單因素試驗及響應面試驗對其產苯乳酸發酵條件進行優化，以期為進一步實現乳酸菌工業化生產苯乳酸生物防腐劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株50株乳酸菌：分離自草魚（CY）、刀魚（DY）、鏡鯉（LJ）、牙鲆（YP）和鱸魚（LY）等腸道，均保藏在本實驗室。

1.1.2 試劑

MRS液體培養基（pH5.0）、MRS固體培養基：上海吉至生化科技有限公司；苯丙酮酸、三氟乙酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；乳酸菌生化鑒定管：上海澤葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級）：上海易恩化學技術有限公司；苯乳酸標準品（純度99%）：上海源葉生物科技有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物、TaqPCR Master、mixDNA marker-D：上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SPX-150B高智能恒溫恒濕培養箱：山東霍爾德電子科技有限公司；KS50R臺式高速冷凍離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；DL-CJ-2N超凈工作臺：北京東聯哈爾濱儀器制造；HT8300/8500全自動凝膠成像分析系統、HT-ECP3000高壓電泳儀電源：北京鴻濤基業科技發展有限公司；PHB-4 pH計：廣州瑞彬科技有限公司；Nikon尼康c1生物顯微鏡：北京長恒榮創科技有限公司；LC-2030高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高產苯乳酸乳酸菌的篩選

將乳酸菌以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h后，以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養24 h[16]。發酵液經8 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的濾膜過濾，得到乳酸菌的無細胞上清液。參照侯楠楠等[17]高效液相色譜法檢測苯乳酸的產量，篩選出苯乳酸產量高的乳酸菌菌株。

1.3.2 高產苯乳酸乳酸菌菌株的鑒定

形態學觀察：采用四區劃線法對高產苯乳酸的乳酸菌菌株進行培養，觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色，采用顯微鏡進行細胞形態學觀察[18]。

生理生化鑒定：將高產苯乳酸的乳酸菌用接種針接種到生理生化鑒定管中，30 ℃培養24～48 h后觀察并記錄結果[19-20]。

16S rDNA序列分析：采用DNA快速抽提試劑盒提取乳酸菌DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3'）對菌株的16S rDNA基因序列進行PCR擴增，PCR擴增體系及條件參照崔天琦等[21]的方法。將擴增后的產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將擴增成功的產物委托上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序得到的16S rDNA基因序列提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，與已知模式菌株的16S rDNA基因序列進行基本局部序列比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，尋找同源性較高的菌株，并利用MEGA5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.3 高產苯乳酸乳酸菌菌株發酵條件優化

（1）單因素試驗

通過控制單一變量法對乳酸菌菌株產苯乳酸發酵條件進行優化。

接種量的影響：將乳酸菌菌株分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，采用HPLC法檢測菌株培養液中苯乳酸產量，以確定適宜接種量。

發酵時間的影響：將乳酸菌菌株以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養基中，分別在37 ℃條件下培養12 h、24 h、48 h、60 h、72 h后，采用HPLC法檢測菌株培養液中苯乳酸產量，以確定適宜發酵時間。

初始pH值的影響：將乳酸菌菌株以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸、初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，采用HPLC法檢測菌株培養液中苯乳酸產量，以確定適宜初始pH值。

發酵溫度的影響：將乳酸菌菌株以2%（V/V）的接種量接種到含5 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養基中，分別于25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃條件下培養24 h，采用HPLC法檢測菌株培養液中苯乳酸產量，以確定適宜發酵溫度[22-24]。

（2）響應面試驗

根據單因素試驗結果，以苯乳酸產量為響應值（Y），選擇接種量（A）、發酵時間（B）、初始pH值（C）和發酵溫度（D）為自變量，采用Design Expert 13設計Box-Behnken響應面試驗優化乳酸菌產苯乳酸的發酵條件。響應面試驗因素及水平見表1。

表1 發酵條件優化Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for fermentation process conditions optimization

1.3.4 數據處理與統計分析

運用Design Expert 13軟件對回歸模型進行分析。試驗均平行測定3次，結果用“平均值±標準差”表示，并采用IBM SPSS 23.0軟件以及OriginPro 9.5軟件對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 高產苯乳酸乳酸菌的篩選

50株乳酸菌在含5 g/L苯丙酮酸MRS液體培養基中培養，發現只有20株乳酸菌能正常生長，通過HPLC測定20株乳酸菌菌株合成苯乳酸的能力，結果見表2。

表2 20株乳酸菌菌株苯乳酸含量的測定結果Table 2 Determination results of phenyllactic acid contents of 20 lactic acid bacteria strains

由表2可知，9株乳酸菌菌株的苯乳酸含量＞1.00mg/mL，其中乳酸菌菌株DY2的苯乳酸產量顯著高于其他乳酸菌菌株（P＜0.05），為2.45 mg/mL。侯楠楠等[25]篩選得到1株產苯乳酸含量較高的乳酸菌BLCC2-0069，該菌株以5 g/L苯丙酮酸為底物發酵24 h時，苯乳酸的產量達到2.55 mg/mL，與本研究菌株DY2的苯乳酸產量相近。因此，確定菌株DY2為高產苯乳酸菌株。

2.2 高產苯乳酸乳酸菌DY2的鑒定

2.2.1 形態觀察

菌株DY2的菌落及細胞形態見圖1。由圖1可知，菌株DY2的菌落呈圓形或橢圓形、光滑、乳白色、不透明、周圍有溶鈣圈，革蘭氏染色結果呈陽性，菌體形態為桿狀。

圖1 乳酸菌菌株DY2的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of lactic acid bacteria strain DY2

2.2.2 生理生化試驗

菌株DY2的生理生化試驗結果見表3。由表3可知，菌株DY2可發酵纖維二糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、蜜二糖肉湯、果糖、松三糖肉湯、半乳糖、七葉甘，不能發酵乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖酸鹽、棉籽糖、山梨醇、木糖，結合形態觀察，根據《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[20]，初步判定菌株DY2為魏斯氏菌屬（Weissellasp.）。

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表3 乳酸菌菌株DY2的生理生化試驗結果Table 3 Physiological and biochemical tests results of lactic acid bacteria strain DY2

2.2.3 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列，菌株DY2的系統發育樹見圖2。由圖2可知，菌株DY2與融合魏斯氏菌（Weissella confuse）5952聚于一支，相似度達到99%，親緣關系最近，因此，鑒定菌株DY2為融合魏斯氏菌（Weissella confuse）。

圖2 基于16S rDNA基因序列乳酸菌菌株DY2的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria strain DY2 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 乳酸菌菌株DY2產苯乳酸發酵工藝優化

2.3.1 單因素試驗

接種量、發酵時間、初始pH值和發酵溫度對融合魏斯氏菌DY2產苯乳酸的影響見圖3。

圖3 接種量（a）、發酵時間（b）、初始pH值（c）及發酵溫度（d）對融合魏斯氏菌DY2苯乳酸產量的影響Fig.3 Effects of inoculum (a), fermentation time (b), initial pH (c) and fermentation temperature (d) on phenyllactic acid production by Weissella confuse DY2

由圖3a可知，接種量對乳酸菌DY2合成苯乳酸的能力有較大的影響，當接種量在1%～3%的范圍內，隨著接種量的增加，苯乳酸產量逐漸增加，說明在一定接種量范圍內，接種量越大，菌株代謝越快，從而使苯乳酸產量增加[26]；當接種量為3%時，苯乳酸產量最高，為2.54 mg/mL；當接種量＞3%之后，隨著接種量的增加苯乳酸產量逐漸減少，分析原因可能是較高的接種量導致菌株繁殖速度過快，造成營養物質不足，從而導致乳酸菌合成苯乳酸的能力降低，這與黃國昌等[26]研究結果相似。因此，確定最優接種量為3%。

由圖3b可知，發酵時間對乳酸菌DY2合成苯乳酸的能力也有很大的影響，當發酵時間在12～72 h的范圍內，隨著發酵時間的延長，苯乳酸產量呈先升高后下降的趨勢。當發酵48 h時，苯乳酸產量最高，為2.37 mg/mL。發酵時間＞48 h后，苯乳酸的產量下降，分析原因可能是隨著發酵時間的延長，營養物質不斷被消耗，營養物質減少到一定程度后導致苯乳酸的產量開始有所減少[27]。因此，確定最佳發酵時間為48 h。

由圖3c可知，隨著初始pH值的升高，苯乳酸產量呈先升高后下降的趨勢，當初始pH值為6.0時，苯乳酸產量達到最高，為2.65 mg/mL。初始pH值偏高或偏低都會影響苯乳酸含量的下降，這可能是因為pH值偏高或偏低都會影響菌株細胞內酶的反應環境以及菌株的生長[28-29]，從而影響乳酸菌合成苯乳酸的產量。因此，確定最佳初始pH值為6.0。

2.3.2 響應面試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，選取接種量（A）、發酵時間（B）、初始pH值（C）、發酵溫度（D）4個因素作為影響因子，以苯乳酸產量（Y）為響應值，采用Design Expert 13設計4因素3水平的Box-Behnken試驗，試驗設計及結果見表4，回歸模型方差分析見表5。

表4 乳酸菌菌株DY2產苯乳酸發酵條件優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of phenyllactic acid production by lactic acid bacteria strain DY2

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

使用Design Expert 13軟件對不同培養條件下苯乳酸產量進行多元回歸擬合計算，得到接種量、發酵時間、初始pH值、發酵溫度對苯乳酸含量的二次多項回歸模型方程：Y=2.91+0.139 2A+0.059 2B+0.008 3C-0.013 3D-0.120 0AB-0.032 5AC-0.010 0AD-0.010 0BC+0.002 5BD+0.002 5CD-0.364 2A2-0.134 2B2-0.080 4C2-0.375 4D2。

由表4可知，回歸模型P值為0.000 1＜0.05，極顯著，失擬項P值為0.172 4＞0.05，不顯著。決定系數R2=93.64%，說明該模型的相關性較好，校正決定系數R2Adj=87.28%，說明該模型的預測值與實測值擬合效果較好，能解釋本試驗87.28%響應值的變化情況。方差結果分析得出，一次項A及二次項A2、B2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B、交互項AB及二次項C2對結果影響顯著（P＜0.05），其他項則對結果影響不顯著（P＞0.05）。

響應面圖和等高線圖可以用來直觀地表示各變量之間的交互作用及響應值在極點時各自變量的最佳水平，響應曲面坡度越陡，等高線越趨于橢圓形，說明對響應值影響越大[26]。接種量和發酵時間間交互作用對苯乳酸產量影響的響應面和等高線見圖4。

圖4 接種量和發酵時間交互作用對苯乳酸產量影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between inoculum and fermentation time on phenyllactic acid production

由圖4可知，接種量（A）與發酵時間（B）間交互作用的響應面圖曲面坡度明顯，等高線為橢圓形，表明二者間交互作用對苯乳酸產量影響顯著，這與方差分析結果一致。

通過回歸方程得到回歸模型預測的最佳發酵條件為接種量3.168%，發酵時間49.738 h，初始pH值6.005，發酵溫度33.942 ℃，此時苯乳酸產量的最大預測值為2.926 mg/mL。為便于實際操作，將最佳條件修訂為接種量3%，發酵時間50 h，初始pH值6.0，發酵溫度34 ℃。為驗證模型的可靠性和最大預測值的準確性，用上述最佳發酵條件進行三次平行驗證試驗，苯乳酸產量實際值為2.99 mg/mL，與預測值接近，說明該模型能準確反映各因素的變化與苯乳酸產量之間的關系。

3 結論

本研究從魚腸道來源的50株乳酸菌中篩選獲得1株高產苯乳酸菌株DY2，苯乳酸產量為2.45 mg/mL；通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定其為融合魏斯氏菌（Weissella confuse）。以苯乳酸產量為響應值，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計優化確定菌株DY2產苯乳酸的最適發酵條件為接種量3%、發酵時間50 h、初始pH值6.0、發酵溫度34 ℃。在此條件下，苯乳酸產量為2.99 mg/mL，是優化前的1.22倍。