基于智能感官和HS-SPME-GC-MS技術分析火龍果發酵酒的風味

于志海，何書成，董文軒，石明芝，袁葉鑫，張美星，黃名正，劉曉柱，劉曉輝，龔 勛

（貴州理工學院 食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003）

火龍果是熱帶和亞熱帶的重要水果[1]，常見栽培品種為紅皮紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）、黃皮白肉火龍果（H.megalanthus）和紅皮白肉火龍果（H.undatus）。貴州地處中國西南部，屬亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫14～16 ℃[2]，在海拔700 m以下的南盤江、北盤江、紅水河流域及海拔低于500 m的赤水河流域均適合火龍果的種植，貴州種植面積比較廣的品種為紅肉火龍果，主要分布在關嶺、貞豐、羅甸、望謨、鎮寧、冊亨6縣，總面積超6 666.67 hm2[3]。

火龍果富含甜菜素等功能性物質，具有抗氧化[4-5]、抗病毒[6]和抗癌活性[7]，并且紅肉火龍果提取物可降低雄性大鼠劇烈運動后的乳酸水平和肌酸激酶活性[8]和增強骨髓間充質干細胞的增殖與成骨分化[9]，改善胃潰瘍[10]，降低心血管疾病風險，改善個體的內皮功能和動脈硬度[11-12]。火龍果中的甜菜素[10]作為著色劑以及火龍果肉逐漸以更重要的角色加入到人類的日常飲食中[11]?；瘕埞l酵酒是以火龍果為原料經酒精發酵后釀造成的果酒[13]。風味是評價果酒品質的關鍵指標，目前，已有火龍果發酵酒風味研究的相關報道，程志華等[14]研究了以廣東市售新鮮紅心火龍果為原料釀造的火龍果發酵酒中的香氣物質，結果表明，其香氣物質主要為醇類和酯類物質，包括乙醇、癸酸乙酯、苯乙醇、正癸酸等；陳爍[15]以貴州紅心火龍果為原料，采用酵母一次發酵、紅曲二次發酵的工藝釀造發酵酒的特征風味成分為乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯等；李凱等[16]以越南紅心火龍果為原料釀造的火龍果發酵酒中的香氣物質主要為己酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯等，不同產地的紅心火龍果所釀造的發酵酒的主要香氣成分存在較大差異。

為了進一步探明產地和采收時間對紅肉火龍果發酵酒品質的影響，本實驗室前期利用貴州省3個產地（關嶺、羅甸和貞豐）和3個采收時間（8月、9月、10月）的紅肉火龍果釀造了發酵酒，并對其火龍果酒的基本質量進行了評價[1]。本研究在此基礎上利用智能感官技術（電子鼻和電子舌）對不同采收時間（8月、9月、10月）及貴州產地（關嶺、羅甸、貞豐）火龍果的發酵酒氣味及滋味特征進行研究，對其進行主成分分析（principal component analysis，PCA），并采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜（headspace solidphase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，HSSPME-GC-MS）聯用儀對其揮發性風味成分進行分析，以期揭示不同產地和采收季節火龍果釀造發酵酒的風味差異規律，為貴州省火龍果發酵酒的品質控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果發酵酒：關嶺地區8、9、10月產火龍果釀造酒（編號為G8、G9、G10）、羅甸地區8、9、10月產火龍果釀造酒（編號為L8、L9、L10）、貞豐地區8、9、10月產火龍果釀造酒（編號為Z8、Z9、Z10），貴州理工學院釀制而成[1]；無水乙醇、無水硫酸鈉、氯化鈉、氯化鉀（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司；酒石酸（分析純）：天津市優普化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-5M低速大容量冷凍離心機：湖南平凡科技有限公司；SA402b型電子舌味覺分析系統：日本INSENT公司；PEN3型電子鼻：德國AIRSENSE公司；FA224型分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-4D型數顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；PAL型自動頂空固相微萃取裝置（HS-SPME）、TQ8040NX型氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻的測定

電子鼻是一種仿生嗅覺技術，可無損、快速和靈敏地對樣品中揮發性氣味信息進行全面評估[12]。取樣品10 mL于電子鼻專用進樣瓶中，富集氣體15 min，用電子鼻專用采集與數據處理軟件Winmuster 1.6.2進行檢測分析。電子鼻程序設置為清洗200 s；歸零5 s；準備5 s；進樣測量100 s，氣體流量為200 mL/min。電子鼻傳感器響應的敏感物質見表1。

表1 電子鼻傳感器響應的敏感物質Table 1 Sensitive substances responded by electronic nose sensors

1.3.2 電子舌的測定

電子舌是一種仿生味覺分析設備，能基于人工味覺傳感器陣列脂膜電勢的變化，客觀地反映食品滋味的變化[17]。每個樣品取70 mL，分在兩個樣品杯中待測。在室溫環境下，檢測樣品的酸味、咸味、苦味、澀味、鮮味、苦味后味、澀味后味和味覺豐富度8種味覺響應值，每個樣品重復檢測4次，舍棄第1次的測量值，取后3次測量值的平均值為最后結果。電子舌程序設置為電極清洗1：90 s；電極清洗2：120 s；電極清洗3：120 s；傳感器自檢：30 s，傳感器電信號輸出值在0±0.5之內視為自檢通過，否則重新進行自檢，直到自檢通過；樣品測量：30 s；電極清洗4：3 s；電極清洗5：3 s；后味測量：30 s。電子舌傳感器的性能見表2。

表2 電子舌傳感器的性能Table 2 Performance of electronic tongue sensors

1.3.3 HS-SPME-GC-MS分析

采用HS-SPME-GC-MS檢測火龍果發酵酒的揮發性風味成分。

HS-SPME條件：取8 mL火龍果酒置于20 mL頂空瓶中，同時加入2.0 g NaCl和2 μL環己酮（內標物），用聚四氟乙烯隔墊密封。40 ℃平衡15 min后，保持40 ℃頂空萃取30 min，之后插入GC進樣口以不分流模式解吸2 min。

GC-MS條件：InertCap Wax毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序為初始溫度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；載氣為高純氦氣（He）（≥99.999%），流速為1.88 mL/min；進樣口溫度240 ℃。電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質譜接口溫度250 ℃；質量掃描范圍29～500 m/z。

定性定量分析：利用揮發性成分檢索系統美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）譜庫，選取相似度＞90%的化合物進行初步定性，并采用線性保留指數（linear retention index，LRI）進一步定性，結合相關文獻資料確定火龍果酒中的揮發性成分。采用內標法對揮發性成分的含量進行相對定量。目標化合物的峰面積與內標物（環己酮）的峰面積之比與內標物的質量濃度的乘積即為目標化合物的相對質量濃度[11]。其計算公式如下：

式中：AS為內標物的峰面積；Ai為目標化合物的峰面積；ρs為內標物的質量濃度，μg/L；ρi為目標化合物的質量濃度，μg/L。

為了明確火龍果發酵酒樣品揮發性風味化合物的貢獻度，分析了各種火龍果發酵酒的相對風味活性值（relative odour activity value，ROAV）。相對風味活性值可評價特定揮發性化合物對酒體的貢獻度，ROAV＞1時，該化合物對酒體香氣有突出貢獻，反之ROAV＜1表明該化合物對酒體香氣的貢獻不突出[18]。利用當前能查到的閾值計算了火龍果酒中主要揮發性風味化合物的OAV。

1.3.4 數據處理

利用Origin 8.0進行數據分析，GraphPad Prism 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同產地和采收時間火龍果發酵酒的氣味特征

火龍果發酵酒的電子鼻傳感器響應雷達圖和主成分分析散點圖見圖1。由圖1a可知，傳感器W1C、W3C、W6S、W5C和W2W對所有樣品的響應值均較低，說明樣品中均含有較低含量的芳香成分化合物、氨類化合物、氫化物、短鏈烷烴類化合物和有機硫化合物。傳感器W1S、W1W、W3S、W2S、W5S對所有火龍果發酵酒的響應值較高，尤其在樣品L9中的響應值最高，說明樣品中的甲基類化合物、無機硫化合物、長鏈烷烴、醇類和醛酮類、氮氧化合物的含量較高。

圖1 火龍果發酵酒的電子鼻傳感器響應雷達圖（a）和主成分分析散點圖（b）Fig.1 Electronic nose sensor response radar diagram (a) and principal component analysis scatter diagram (b) of fermented dragon fruit wine

由圖1b可知，主成分（principal component，PC）1和PC2的方差貢獻率分別為76.07%和14.95%，累計方差貢獻率為91.02%，各個樣品主要集中在3個區域，除了樣品L9以外，樣品G8、L8、Z8，樣品G9、Z9及樣品G10、L10、Z10分別集中在一個區域，說明在該組樣品中，采收季節是影響火龍果發酵酒風味特征的關鍵因素，而產地的影響效力不及采收季節；樣品L9及Z10在橫軸上不能區分，且二者均位于象限交界處，說明二者具有類似的風味特征，這可能與貞豐和羅甸幾乎位于同一緯度有關[1]。

2.2 不同產地和采收時間火龍果發酵酒的滋味特征

不同產地和采收時間的火龍果發酵酒電子舌傳感器響應雷達圖見圖2。由圖2a～2c可知，8月份采收火龍果制備的發酵酒的酸味響應值均比9、10月份高，其余滋味的響應值均最低。關嶺地區9、10月份采收火龍果的發酵酒滋味響應值由高到低為咸味、鮮味、苦味、后味A、后味B、澀味、豐富度、酸味，9月份采收火龍果的發酵酒各滋味響應值均低于10月份樣品，貞豐和羅甸地區火龍果發酵酒的滋味響應值類似于關嶺地區，但貞豐地區9、10月份采收火龍果的發酵酒的滋味響應值更接近。結果表明，同一產地不同采收季節火龍果的發酵酒滋味特征存在著明顯差異，說明采收季節對火龍果酒的風味影響較大。為了進一步確定導致這種差異的因素，考察不同產地同一采收季節火龍果發酵酒的滋味特征，由圖2d～2f可知，不同產地同一采收時間火龍果發酵酒的滋味特征幾乎一致，但不同采收時間火龍果發酵酒的電子舌傳感器響應值卻有著明顯差異，8月份采收火龍果的發酵酒酸味響應值要明顯高于其他兩個采收月份，而在9、10月份采收火龍果的發酵酒的咸味、鮮味和苦味響應值要明顯高于8月份。

圖2 火龍果發酵酒的電子舌傳感器響應雷達圖Fig.2 Electronic tongue sensor response radar diagram of fermented dragon fruit wine

結果表明，影響火龍果發酵酒滋味特征的環境因素中，采收時間要比產地更突出。進一步對不同產地、不同采收時間的火龍果發酵酒進行主成分分析，結果見圖3。由圖3可知，不同采收時間的火龍果發酵酒在PC1上具有良好的區分度，同一采收時間不同產地火龍果發酵酒在PC2上的區分度不及采收時間。

圖3 基于電子舌檢測結果火龍果發酵酒的主成分分析散點圖Fig.3 Principal component analysis scatter diagram of fermented dragon fruit wine samples based on electronic tongue detection results

綜上，采收季節對火龍果酒的滋味影響大于產地因素，8月份采收火龍果的發酵酒酸味值高于其余兩個月份，而咸味、鮮味和苦味值卻不及9月和10月。

2.3 不同產地和采收時間火龍果發酵酒的揮發性風味成分分析

不同火龍果發酵酒樣品中的揮發性風味成分種類和含量見表3。由表3可知，從火龍果發酵酒樣品中共檢出67種揮發性化合物，其中，酯類35種、醇類17種、酸類2種、芳香族化合物3種、醛酮類化合物3種和其他類7種，樣品G8中的揮發性風味成分種類最多，為54種，樣品G10中的揮發性風味成分種類最少，為39種。對于同一產地采收火龍果所釀造的發酵酒，除了貞豐地區樣品外，關嶺、羅甸地區樣品揮發性風味成分的種類均呈現下降趨勢。不同產地同一采收時間火龍果的發酵酒樣品中的揮發性風味成分種類數多少排序為樣品G8（54）＞L8（49）＞Z8（40），樣品G9（53）＞Z9（49）＞L9（48），樣品L10（44）＞Z10（40）＞G10（39）。

表3 不同火龍果發酵酒樣品中的揮發性風味成分種類及含量Table 3 Types and contents of volatile flavor compounds in different fermented dragon fruit wine samples

從不同樣品中揮發性風味成分的含量水平來看，酯類物質和醇類物質是所有樣品中揮發性風味成分的主要成分，其中酯類物質含量為1.24～10.14 mg/L，醇類物質含量為4.33～10.78 mg/L。在同一種樣品中，這2種揮發性風味成分的含量均分別顯著高于其余各類揮發性物質的含量，這與廣東市售新鮮紅心火龍果釀造的發酵酒主要香氣成分的研究結果一致[14]。

為了進一步明確上述主要揮發性風味成分中對風味的呈現有突出貢獻的物質，對這些樣品中的揮發性風味成分進行ROAV分析，火龍果發酵酒樣品的ROAV見表4。由表4可知，9種發酵酒樣品中ROAV＞1的揮發性風味成分共14種，共有揮發性風味成分為4種，分別為乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和（Z）-2,3-丁二醇。樣品G8中ROAV＞1的物質共10種，含5種酯類物質（乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯和辛酸異戊酯）、4種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇、芳樟醇、香葉醇和2-十七醇]和1種芳香族化合物（2-甲基萘），其中壬酸乙酯、香葉醇和2-甲基萘為其獨有。樣品L8中ROAV＞1的物質共7種，含5種酯類物質（2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯和辛酸乙酯）和2種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇和芳樟醇]。樣品Z8中ROAV＞1的物質共5種，含3種酯類物質（乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯和辛酸乙酯）和2種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇和2-庚醇]，其中2-庚醇為其獨有。樣品G9中ROAV＞1的物質共8種，含5種酯類物質（2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯和辛酸乙酯）、3種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇、芳樟醇和2-十七醇]。樣品L9中ROAV＞1的物質共5種，含4種酯類物質（3-甲基丁酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）和1種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇]。樣品Z9中ROAV＞1的物質共7種，含5種酯類物質（乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸異戊酯和月桂酸乙酯）、2種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇和2-十七醇]，其中月桂酸乙酯為其獨有。樣品G10中ROAV＞1的物質共5種，含3種酯類物質（乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯和辛酸乙酯）、2種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇和芳樟醇]。樣品L10中ROAV＞1的物質共5種，含4種酯類物質（乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和辛酸異戊酯）、1種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇]。樣品Z10中ROAV＞1的物質共5種，含3種酯類物質（乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯和辛酸乙酯）、2種醇類物質[（Z）-2,3-丁二醇和芳樟醇]。結果表明，乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和（Z）-2,3-丁二醇在火龍果發酵酒中穩定存在，是貴州紅肉火龍果發酵酒的特征香氣成分，不受采收季節和產地因素的影響。另外10種揮發性風味成分會受相應影響，綜合來看，關嶺產火龍果發酵酒的香氣最馥郁，特別是關嶺8月份產火龍果發酵酒的香氣最馥郁，羅甸和貞豐產火龍果發酵酒的香氣馥郁程度相差不大。

表4 火龍果發酵酒樣品的相對氣味活度值Table 4 Relative odour active value of fermented dragon fruit wine samples

3 結論

本研究利用智能感官技術（電子鼻和電子舌）及頂空固相微萃取-氣質聯用技術（HS-SPME-GC-MS）對貴州產地（關嶺、羅甸和貞豐）和采收時間（8月、9月和10月）的火龍果所釀造發酵酒的揮發性風味成分進行了系統的研究。結果表明，火龍果發酵酒富含甲基類化合物、無機硫化合物、長鏈烷烴、醇類和醛酮類、氮氧化合物，8月份采收火龍果的發酵酒酸味響應值高于9月和10月。樣品中共檢出67種揮發性化合物，包括酯類35種、醇類17種、酸類2種、芳香族化合物3種、醛酮類3種和其他類7種。其中，ROAV＞1的揮發性風味成分共14種，貴州產紅肉火龍果發酵酒的特征香氣成分為乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和（Z）-2,3-丁二醇。關嶺產火龍果發酵酒的香氣最馥郁，特別是關嶺8月份產火龍果發酵酒的香氣最馥郁，羅甸和貞豐產火龍果發酵酒的香氣馥郁程度相差不大。采收季節對滋味和風味的影響大于產地因素，但二者對貴州紅肉火龍果的特征揮發性風味成分沒有影響。本研究對貴州省火龍果發酵酒的品質控制具有參考價值，同時對火龍果發酵酒行業的發展提供了有價值的參考。