鮮食葡萄降酸酵母菌的篩選、鑒定及釀造特性研究

呂銀德，趙俊芳*，秦令祥

（漯河食品職業學院 食品工程系，河南 漯河 462300）

葡萄酒釀造是一個復雜的多菌種參與的生物轉化過程，主要包括由酵母菌完成的乙醇發酵和由乳酸菌完成的蘋果酸乳酸發酵[1]。乙醇發酵是葡萄酒釀造中最主要的發酵過程，在此過程中，糖類物質被轉化為乙醇和二氧化碳，同時產生其他代謝產物。根據酵母菌酒精產能特性，其被分為釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母菌（non-Saccharomycesyeast）。釀酒酵母菌具有較強的乙醇耐受性和乙醇代謝能力，在發酵過程中通過轉化糖類可產生大量乙醇；而非釀酒酵母菌在發酵過程中可產生甘油、酸類、酯類、醛類、高級醇等多種次級代謝物，決定著葡萄酒的風味、豐富性和復雜度，使葡萄酒具有獨特的典型性[2-4]。蘋果酸乳酸發酵是葡萄酒釀造中繼乙醇發酵后重要的二次發酵，在此過程中釀酒乳酸菌—酒類酒球菌（Oenococcus oeni）將蘋果酸轉化為乳酸和二氧化碳，同時產生其他代謝產物[5]。蘋果酸乳酸發酵具有降低葡萄酒酸度、提高葡萄酒生物穩定性和增加葡萄酒香氣等多種作用，是釀造紅葡萄酒和部分白葡萄酒的重要步驟，對葡萄酒口感、風味和典型性具有重要影響[6-7]。

通常情況下乙醇發酵結束后葡萄酒具有較高的酸度，其主要是由酸度較高的蘋果酸和酒石酸造成[8]。過高的酸度對葡萄酒口感和品質具有較大的負面影響，令消費者難以接受，因此乙醇發酵結束后進行降酸處理是葡萄酒釀造中的必要步驟。通常蘋果酸是在乙醇發酵結束后的蘋果酸乳酸發酵階段通過乳酸菌將其降解為一元酸乳酸，從而達到降酸的目的[9-11]。而目前在乙醇發酵階段通過酵母菌將蘋果酸降解為乳酸的研究還較少。部分鮮食葡萄酒酸度高，通過生物方法降低酒體酸度也是提高其品質的重要途徑[12-13]。不同來源酵母菌具有不同的功能和發酵特性[14]，將鮮食葡萄來源的酵母菌用于葡萄酒生產可能會產生意想不到的效果，而關于此方面的研究還較少。

本試驗從鮮食葡萄自然發酵液分離出的酵母菌中篩選降酸酵母菌，并對其發酵性能、耐受性和糖苷酶活性進行測定，篩選出具有良好性能的葡萄酒釀造酵母菌。這對提高葡萄酒品質和開發新的酵母菌資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌株：從夏黑葡萄自然發酵液中分離，保存于實驗室，命名為XH1～XH20；商業化酵母菌DV01：上海杰兔生物科技有限公司。

L-蘋果酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-蘋果酸試劑盒：上?？瓢┥锛夹g有限公司；對硝基苯基-β-葡萄糖苷：北京威知生物科技有限公司；溶菌酶：上海生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

蘋果酸降解指示培養基[15]：在YNB培養基的基礎上添加硫酸銨5 g/L，L-蘋果酸20 g/L，溴甲酚綠0.1 g/L，雙蒸水配制，0.45 μm濾膜過濾。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母浸粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；酵母氮源基礎（yeast nitrogen base，YNB）培養基：今品化學技術（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

DSX-280B型式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；JBCJ-V超凈工作臺：蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；PSH-300生化培養箱：中科生命科技股份有限公司；LIOOJS500雙目顯微鏡：無錫萬物生態科技有限公司；UH5300紫外分光光度計：日本日立公司；FE28 pH計：梅特勒-托利多儀器上海股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 降酸酵母菌的篩選

參照白玉峰等[15]所述方法篩選具有L-蘋果酸降解能力的酵母菌。每天觀察并記錄培養基顏色變化，若培養基顏色從黃色變為藍色，說明菌株具有L-蘋果酸降解能力，顏色變化越大說明L-蘋果酸降解能力越強。每株菌做3個平行。

1.3.2 降酸酵母菌的鑒定

參照鄧曉茜等[16]所述方法，提取酵母菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）后，采用通用引物ITS1/ITS4擴增ITS并測序，序列經序列經美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information,NCBI）的Gen Bank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic localalignment search tool,BLAST）進行比對，采用MEGA-7軟件以鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.3 降酸酵母菌的發酵性能測定

產酒精力測定及香氣評價：參照李亞輝等[17]所述的方法，測定酵母菌的產酒精能力并由感官評定小組進行香氣評價，重復測定3次。

發酵力測定：采用董亞晨等[18]所述CO2質量損失法測定酵母菌的發酵能力，重復測定3次，繪制發酵力曲線。

1.3.4 降酸酵母菌的耐受性能測定

葡萄糖耐受性測定：調整YPD培養基葡萄糖的質量濃度分別為150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L，以葡萄糖質量濃度20 g/L為對照[19]。考察其對發酵液活菌數的影響。

乙醇耐受性測定：調整YPD培養基中乙醇體積分數分別為10%、12%、14%、16%、18%、20%，以不添加乙醇為對照[17]?？疾炱鋵Πl酵液活菌數的影響。

SO2耐受性測定：調整YPD培養基中SO2質量濃度分別為100 mg/L、150mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L，以不添加SO2為對照[20]。考察其對發酵液活菌數的影響。

以上均按5%（0.6×106CFU/mL）的接種量接種酵母菌，28 ℃、100 r/min條件下培養48 h，采用血球計數板法測定不同葡萄糖質量濃度、不同乙醇體積分數、不同SO2質量濃度下發酵液中的活菌數，重復測定3次。

1.3.5 降酸酵母菌的糖苷酶活性測定

樣品處理：參照LI Y H等[21]所述方法獲得酵母培養液上清、完整細胞和細胞破碎液。

酶活測定：參照李亞輝等[22]所述方法分別對酵母培養液上清、完整細胞和細胞破碎液進行β-葡萄糖苷酶活測定。酶活定義為：在每克酵母菌（干質量）作用下每分鐘生成對硝基苯酚的量為一個酶活單位，μmol/（g·min）。每個樣品酶活測定重復3次。

1.3.6 降酸酵母菌的降酸性能測定

以夏黑葡萄為原料，分別按0.5%接種量接種篩選的降酸酵母菌，以商業化酵母菌DV01為對照，于25 ℃條件下發酵，當糖含量低于4.0 g/L時發酵結束。利用蘋果酸試劑盒分別在發酵前和發酵后測定發酵液中蘋果酸含量。

1.3.7 數據分析

利用SPSS18.0和Design Expert V8.0數據處理軟件進行數據處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 降酸酵母菌的篩選及鑒定

2.1.1 降酸酵母菌的篩選

20株酵母菌培養后顯色結果見表1。由表1可知，酵母菌XH8降酸能力強，XH10降酸能力較強，XH3和XH15降酸能力弱，其余菌株無降酸能力，故選擇菌株XH8、XH10、XH3和XH15進行后續實驗。

表1 酵母菌在蘋果酸降解指示培養基上的顯色結果Table 1 Chromogenic results of yeasts on malic acid degradation indicator medium

2.1.2 酵母菌的鑒定

篩選出的菌株XH3、XH8、XH10和XH15的菌落和細胞形態見圖1。由圖1可知，4株菌菌落呈圓形，中間凸起，乳白色，質地均勻，表面光滑、濕潤、粘稠，邊緣規整；4株菌細胞形態呈橢圓形，生殖方式為芽殖，無菌絲。菌落和細胞形態均符合酵母菌特點。

圖1 4株降酸酵母菌的菌落和細胞形態Fig.1 Colony and cell morphology of 4 acid-reducing yeasts

菌株XH3、XH8、XH10和XH15的系統發育樹見圖2。由圖2可知，菌株XH3、XH8和XH10與釀酒酵母具有100%相似度，可鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌株XH15與畢赤酵母具有100%相似度，可鑒定為黃皮畢赤酵母（Pichia scutulata）。

圖2 基于ITS基因序列4株降酸酵母菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 4 strains of acid-reducing yeasts based on ITS gene sequence

2.2 降酸酵母菌的發酵性能

2.2.1 產酒精力測定及香氣評價

對篩選的4株酵母菌XH3、XH8、XH10和XH15的產酒精力進行測定，并在培養后進行香氣評價，結果見表2。

表2 4株降酸酵母菌的產酒精力和香氣評價結果Table 2 Results of alcoholic yield and aroma evaluation results of 4 acid reducing yeasts

由表2可知，菌株XH3和XH15具有較強的產酒精能力，發酵液的酒精度分別為7.9%vol和8.3%vol，菌株XH8和XH10的產酒精力較差，發酵液的酒精度分別為4.2%vol和4.8%vol。4株酵母菌發酵后均具有發酵香和酒香。結果表明，菌株XH3和XH15不僅具有較強的產酒精能力，且能產生較好的香氣。

2.2.2 發酵力測定

對篩選的4株降酸酵母菌XH3、XH8、XH10和XH15的發酵力進行測定，結果見圖3。由圖3可知，菌株XH3和XH15的總CO2產生量分別為19.75 g和20.56 g，菌株XH8和XH10的總CO2產生量分別為12.15 g和15.40 g。菌株XH3和XH15的CO2產生量明顯高于菌株XH8和XH10；菌株XH3在發酵前60 h隨著時間延長，CO2產生量逐漸升高，發酵第60小時時，CO2產生量最大為3.3 g，然后隨著時間延長，CO2產生量逐漸下降；菌株XH15在發酵前72 h隨著時間延長產生的CO2量逐漸升高，第72小時時，CO2產生量最大為3.4 g，然后隨著時間延長，CO2產生量逐漸下降。菌株XH8和XH10分別在48 h和72 h CO2產生量最大，之后產量逐漸下降。菌株XH3和XH15具有較強的發酵能力，且高于菌株XH8和XH10。

圖3 4株降酸酵母菌的發酵力曲線Fig.3 Fermentation capacity curves of 4 acid-reducing yeasts

2.3 降酸酵母菌的耐受性能

2.3.1 葡萄糖耐受性

由圖4可知，隨著葡萄糖含量的增加，4株酵母菌的活菌數均逐漸降低；當葡萄糖含量≤200 g/L時，不同葡萄糖含量對4株菌的活菌數影響較小，無顯著差異（P＞0.05）；和葡萄糖含量為200g/L時活菌數相比，葡萄糖含量為250 g/L時對菌株XH10和XH15的活菌數有明顯的抑制作用（P＜0.05），葡萄糖含量為300 g/L時對菌株XH3和XH8的活菌數有明顯的抑制作用（P＜0.05）。結果表明，菌株XH3和XH8的葡萄糖耐受性優于菌株XH10和XH15，菌株XH3和XH8葡萄糖耐受性最高為250 g/L，菌株XH10和XH15葡萄糖耐受性最高為200 g/L。通常情況下，葡萄酒發酵液中糖含量≤250 g/L[23]，因此，在葡萄糖耐受性方面，菌株XH3和XH8可滿足釀酒的需要。

圖4 不同葡萄糖含量對4株降酸酵母生長的影響Fig.4 Effect of different glucose contents on the growth of 4 acid-reducing yeasts

2.3.2 乙醇耐受性

由圖5可知，隨著乙醇體積分數的增加，4株酵母菌的活菌數均逐漸降低；當乙醇體積分數≤8%時，對4株菌的生長影響較?。灰掖俭w積分數為12%時對酵母菌XH8和XH10的活菌數有明顯抑制作用（P＜0.05），乙醇體積分數為14%時對酵母菌XH15的活菌數有明顯抑制作用（P＜0.05），乙醇體積分數為16%時對酵母菌XH3的活菌數有明顯抑制作用（P＜0.05）；菌株XH3的乙醇耐受性最好，最高可耐受14%乙醇，其次為菌株XH15，最高可耐受12%乙醇，菌株XH8和XH10的乙醇耐受性較差，最高可耐受10%vol。通常情況下，葡萄酒的酒精度約為12%vol[22]，因此，在乙醇耐受性方面，菌株XH3和XH15有較好的耐受性，可滿足釀酒的需要。

圖5 不同乙醇體積分數對4株降酸酵母菌生長的影響Fig.5 Effect of different ethanol volume fraction on the growth of 4 acid-reducing yeasts

2.3.3 SO2耐受性測定

由圖6可知，隨著SO2含量的增加，4株菌的活菌數均逐漸降低；當SO2含量為200 mg/L時，對酵母菌XH10的活菌數有顯著的抑制作用（P＜0.05）；當SO2含量為250mg/L時，對酵母菌XH3、XH8和XH15的活菌數有顯著的抑制作用（P＜0.05）；當SO2含量為300 mg/L時，4株菌幾乎不生長。結果表明，酵母菌XH3、XH8和XH15的SO2耐受性強于酵母菌XH10，菌株XH3、XH8和XH15的SO2耐受性最高為200 mg/L，菌株XH10的SO2耐受性最高為150 mg/L。通常情況下，葡萄酒釀造中SO2含量＜200 mg/L[24]，因此，在SO2耐受性方面，菌株XH3、XH8和XH15可滿足葡萄酒釀造的需要。

圖6 不同SO2含量對4株降酸酵母菌生長的影響Fig.6 Effect of different SO2 contents on the growth of 4 acid-reducing yeasts

2.4 降酸酵母菌的糖苷酶活性

由圖7可知，XH3、XH8、XH10和XH15菌株細胞破碎液的β-葡萄糖苷酶活性最高，分別為10.8 μmol/（g·min）、13.2 μmol/（g·min）、12.1 μmol/（g·min）和7.9 μmol/（g·min），其次是完整細胞，分別為5.5μmol/（g·min）、3.2μmol/（g·min）、1.6 μmol/（g·min）和2.1 μmol/（g·min），培養液上清中酶活性最低；菌株XH8細胞破碎液的酶活最高，菌株XH3完整細胞的酶活顯著高于其他3株菌（P＜0.05）。結果說明，4株降酸酵母菌的β-葡萄糖苷酶主要為胞內酶，胞外酶活較低，完整細胞也具有一定酶活；菌株XH8胞內酶活最高，菌株XH3完整細胞酶活最高。β-葡萄糖苷酶可降解香氣前體物產生香氣物質，在葡萄酒釀造中具有重要作用[25]。此結果與前人報道的酵母菌分泌的β-葡萄糖昔酶大多為胞內酶或胞壁結合酶一致[26-27]。

圖7 4株降酸酵母菌β-葡萄糖苷酶活性Fig.7 β-glucosidase activities of 4 acid-reducing yeasts

2.5 降酸酵母菌的降酸性能

降酸酵母菌XH3、XH8、XH10和XH15在以夏黑葡萄為原料發酵液中降解L-蘋果酸的測定結果見表3。由表3可知，菌株XH3和對照菌株DV01的發酵時間最短為195 h，其次是菌株XH15、XH8和XH10；菌株XH8對L-蘋果酸降解量最高，降解量為0.545 g/L，其次是菌株XH10，降解量為0.404 g/L，這兩株菌對L-蘋果酸的降解量均超過對照菌株DV01的降解量0.099 g/L，菌株XH3和菌株XH15對L-蘋果酸的降解量較低，分別為0.091 g/L和0.066 g/L，均低于對照菌株DV01的降解量。結果說明，菌株XH8的降酸能力最強，其次是菌株XH10，菌株XH3和菌株XH15的降酸能力較弱。但是由于菌株XH8耐受乙醇能力較差，所以最終選擇菌株XH3為葡萄酒潛在釀造菌株。

表3 4株降酸酵母菌降解L-蘋果酸的測定結果Table 3 Results of degradation of L-malic acid of 4 acid-reducing yeasts

3 結論

該研究從分離于夏黑葡萄自然發酵液的20株酵母菌中篩選出了4株具有L-蘋果酸降解能力的酵母菌，其中菌株XH8降酸能力最強，其次為菌株XH10，菌株XH3和XH15降酸能力稍弱；菌株XH3具有較好的發酵特性，較好的葡萄糖、乙醇和SO2耐受性，且完整細胞具有較高的β-葡萄糖苷酶活；菌株XH8具有較好的葡萄糖和SO2耐受性、較強的L-蘋果酸降解能力，以及較高的胞內β-葡萄糖苷酶活。綜上，酵母菌XH3可作為葡萄酒釀造的潛在菌株。本研究對開發新酵母菌資源和提高葡萄酒品質具有重要意義。