基于非靶向代謝組學分析不同陳化時間老鷹茶代謝產物的差異

唐佳代，冉光耀，陳 諾，王芙蓉，趙騰飛，冷 枝，王 怡，王士超*

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564500）

老鷹茶（Hawk tea），以樟科毛豹皮樟（Litsea coreanaLevl.var.lanuginosa）的枝葉為原料，通過殺青、揉捻、渥堆和干燥等工藝制成的一種發酵茶[1]，其富含茶多酚、多糖、氨基酸和Al、Zn、Fe等微量元素，具有較高的營養和保健功能，例如抗氧化、降膽固醇、酒精性肝損傷保護等[2-4]。目前，有關老鷹茶的研究多集中于靶向檢測單一特定物質的含量、香氣化合物檢測和提取，缺乏對茶葉中所含代謝物系統的研究[5-7]。老鷹茶的品質與茶原料品種、加工方式等因素相關[8]，成品老鷹茶陳化時長也是影響其品質的關鍵因素之一，在民間有老鷹茶越陳品質越好的說法。

非靶向代謝組學借助色譜、質譜等儀器對生物系統中小分子代謝物進行系統的定性定量分析，通過數據處理和分析準確找出樣本間差異性代謝物[9]，有助于解析生物樣本中代謝物的重要信息[10]。代謝組學檢測技術主要有高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）聯用[11]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用以及核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜等[12]?；贚C-MS聯用的非靶向代謝組學主要應用于檢測樣本中分子質量＜1 000 Da的氨基酸、糖、酮和有機酸等非揮發性相對小分子代謝物[13]。代謝組學技術已應用于探究茶葉加工[14]、發酵[15]、凋萎[16]、茶葉種質[17]及其沖泡茶湯[18]中代謝物的特征差異及種質鑒別[19-20]，所分析的差異代謝物集中于紅茶、白茶等茶葉中的黃酮、兒茶素、有機酸、氨基酸和核苷酸類化合物。目前，尚未見基于非靶向代謝組學探究老鷹茶中代謝產物影響的研究報道。

本研究以產自貴州省正安縣未陳化、陳化1年、2年和3年的老鷹茶為研究對象，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（ultraperformanceliquidchromatography-quadrupoletime-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技術分析老鷹茶中非揮發代謝物組成，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）篩選差異性代謝物，旨在探究陳化對老鷹茶代謝物的影響，為老鷹茶代謝物資源挖掘與利用奠定理論基礎，助力貴州老鷹茶產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老鷹茶A（未陳化，HTa）、老鷹茶B（陳化1年，HTb）、老鷹茶C（陳化2年，HTc）、老鷹茶D（陳化3年，HTd）：均購于貴州省正安縣，在溫度為20～25 ℃條件下進行陳化。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；L-2-氯苯丙氨酸（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（色譜純）：印度HCL公司。

1.2 儀器與設備

UPLC Acquity I-Class PLUS超高效液相色譜、Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters UPLCXevoG2-XSQTOF高分辨質譜（配有電噴霧離子（electric spray ion，ESI）源）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 老鷹茶代謝物的提取

將老鷹茶樣研磨成粉，稱取50 mg，加入1 000 μL甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1（V/V），渦旋30 s。研磨儀45 Hz研磨10 min后置于冰水浴中超聲10 min。-20 ℃條件下靜置1 h后，于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，取500 μL上清液真空濃縮干燥。干燥后的代謝物加入160 μL乙腈水提取液乙腈∶水=1∶1（V/V）復溶，渦旋30 s后置于冰水浴中超聲10 min。將樣本在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min；取120 μL上清液于進樣瓶中上機檢測，每個樣本各取10 μL混合成質量控制樣本（quality control，QC）上機檢測。

1.3.2 超高效液相色譜-質譜檢測條件

超高效液相色譜條件：Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；液相色譜的流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈（含0.1%甲酸）。進樣體積1 μL，流速為400 μL/min。梯度洗脫程序為0～0.25 min，2%流動相B；10 ～13 min，98%流動相B；13.1 min 時，2%流動相B。

質譜條件：采用ESI源正、負離子模式檢測，正離子模式毛細管電壓2 500 V，負離子模式毛細管電壓-2 000 V，錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃；反吹氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h；質核比50～1 200 m/z。

1.3.3 數據處理

使用MassLynx V4.2采集的原始數據，通過Progenesis QI軟件做峰提取、峰對齊等數據處理操作，基于自建庫開展化合物注釋、識別。數據進行多維統計分析，采用Prcomp 3.6.1進行主成分分析，ropls1.6.2進行正交偏最小二乘-判別分析。根據老鷹茶樣品變量投影重要度（variable importance in project，VIP）和T檢驗計算各化合物的差異顯著性P值，以OPLS-DA模型P＜0.05和VIP＞1相結合的方法篩選差異代謝物。并使用Origin 2021軟件繪制差異性代謝物熱圖。

2 結果與分析

2.1 QC樣本檢測

QC樣本相關性越接近于1，說明整個檢測過程穩定性越好[21]。QC樣本相關性均＞0.977，說明質譜檢測的樣品的均一度較好。

2.2 不同陳化時間老鷹茶代謝物的主成分分析

不同陳化時間的老鷹茶樣本中共注釋到4 530個代謝物，為反映不同陳化時間的老鷹茶樣本間代謝物的差異大小，分別在正離子模式和負離子模式下對老鷹茶代謝物進行主成分分析，結果見圖1。由圖1可知，正離子模式下第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）方差貢獻率分別為31.86%和19.96%，累計方差貢獻率為51.82%，負離子模式下第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）方差貢獻率分別為33.82%和17.12%，累計方差貢獻率為50.94%，包含樣本中大部分代謝物信息。主成分分析得分圖中單個散點代表一個QC樣本點，樣本點間的距離越大代表樣本間代謝物的組成和含量差異越大，樣本點間的距離越小代表樣本間代謝物組成和含量差異越小[22]。在正離子模式和負離子模式下，未經陳化的老鷹茶樣本（HTa）點與陳化的老鷹茶樣本（HTb、HTc、HTd）點間距離較遠，說明經過陳化后老鷹茶中代謝物有明顯變化。經過陳化的三個老鷹茶（HTb、HTc、HTd）樣本點在PC1上較為靠近，說明陳化1年、2年和3年的老鷹茶樣本代謝物的種類和含量差異較小。

圖1 正離子模式（A）和負離子模式（B）下老鷹茶代謝物主成分分析得分圖Fig.1 Score plots of principal component analysis of Hawk tea metabolites under positive ion (A) and negative ion (B) mode

2.3 不同陳化時間老鷹茶代謝物的正交偏最小二乘-判別分析

OPLS-DA模型得分圖中橫坐標（t1）代表組間差異分量，樣本點橫向距離大小與組間差異成正比?？v坐標（to1）代表組內差異分量，樣本點縱向距離大小與組內差異成正比。括號中的百分比代表該分量在總方差中的占比[23]。指標Q2Y是評價模型的預測參數之一，表示模型的預測能力即所建模型能否通過代謝表達量區分正確的樣本分組，Q2Y越接近于1時表示模型越穩定可靠，即可以用此模型篩選差異代謝物[24]。不同陳化時間的老鷹茶代謝物的OPLS-DA得分圖見圖2。由圖2可知，Q2Y均＞0.887，表明所建立的OPLS-DA模型有效。兩兩樣本間橫向距離較大且均處于95%置信區間，表明不同陳化時間老鷹茶樣本的代謝物具有顯著差異（P＜0.05）。

為檢查OPLS-DA模型的可靠性，進行置換檢驗，按置換分組進行OPLS-DA建模計算其R2Y和Q2Y，將建模結果繪制成散點圖，圖中x軸表示置換分組與原模型分組的相關性，y軸表示R2Y或者Q2Y的取值（其中在x軸取1的R2Y和Q2Y為原模型的值），藍點和紅點分別代表置換后模型的R2Y和Q2Y，兩條虛線為R2Y和Q2Y擬合的回歸線。若Q2Y擬合回歸線斜率為正則說明模型有意義，藍點普遍位于紅點上方代表其檢測值都低于真實值，說明建模訓練集和測試集的獨立性較好[25]。為驗證模型是否過擬合設置假設檢驗的次數為200，繪制不同陳化時間的老鷹茶代謝物的OPLS-DA置換檢驗圖見圖3。由圖3可知，不同陳化時間的老鷹茶兩兩樣本組的Q2Y擬合回歸線斜率均＞1，檢測值都低于真實值，Q2Y的回歸線截距小于0.5，證明所建立的OPLS-DA模型沒有過擬合[26]。

圖3 不同陳化時間老鷹茶代謝物的正交偏最小二乘-判別分析置換檢驗圖Fig.3 Permutation test diagram of orthogonal partial least squares-discriminant analysis of Hawk tea metabolites with different aging time

2.4 不同陳化時間老鷹茶差異顯著代謝物篩選及分析

基于OPLS-DA結果，根據OPLS-DA模型的VIP≥1且P＜0.05的代謝物篩選老鷹茶組間差異顯著代謝物。隨著陳化時間的增加，老鷹茶樣本中差異顯著代謝物數量逐漸上升。未陳化老鷹茶樣本與陳化1年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數為832個，其中上調的差異顯著代謝物為448個（占比53.85%），下調差異顯著代謝物為384個（占比46.15%）。未陳化老鷹茶樣本與陳化2年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數為925個，其中上調的差異顯著代謝物498個（占比53.84%），下調差異顯著代謝物為427個（占比46.16%）。未陳化老鷹茶樣本與陳化3年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數為1 071個，其中上調的差異顯著代謝物為644個（占比60.13%），下調差異顯著代謝物為427個（占比39.87%）。結果表明，陳化3年老鷹茶樣本差異顯著代謝物數最多。

通過比對不同陳化時間的老鷹茶中氨基酸類、多酚類、嘌呤類化合物等影響發酵茶滋味的主要物質差異[27]，分析陳化時間對老鷹茶滋味成分的影響，結果見圖4。

圖4 不同陳化時間的老鷹茶顯著差異代謝物熱圖Fig.4 Heat map of significant difference metabolites of Hawk tea with different aging time

由圖4可知，經過陳化的老鷹茶中氨基酸、肽和類似物顯著差異代謝產物有12種，其中含量隨陳化時間增加的物質有泛酰巰基乙胺4'-磷酸、L-天冬氨酸、肌酸、精氨酰基賴氨酸、高甲硫氨酸、2-氨基-6-半醛，在陳化過程中隨著茶葉蛋白質分解，氨基酸類物質含量明顯提高。含量隨陳化時間降低的物質有L-苯丙氨酸、L-多巴色素、4-磷酸-L-天冬氨酸、谷胱甘肽、番杏多巴黃素和環絲氨酸。氨基酸是貢獻茶湯香氣和滋味的主要物質，對茶葉品質的形成有重要作用[28]。L-天冬氨酸屬于鮮味氨基酸，是茶湯鮮爽味的主要來源之一[29]。肌酸存在于骨骼肌中，是合成磷酸肌酸的原料，磷酸肌酸可促進人體腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的合成，為機體運動提供能量[30]。L-苯丙氨酸是茶葉中苦味物質和重要的香氣成分，其是合成茶葉香氣物質揮發性苯丙酸/苯類化合物的前體物質[31]，伴隨著茶葉香氣化合物的合成，其含量有所減少。在陳化中與氧氣長期接觸，茶葉中其含量有所減少。

在不同陳化時間老鷹茶的差異代謝物中黃酮醇類有表兒茶素和（-）-表兒茶素、黃杉素和紫鉚黃酮4種物質。其中表兒茶素和（-）-表兒茶素相對含量較高，但隨著陳化時間延長，其含量均呈現下降趨勢。不同陳化時間老鷹茶樣本中差異代謝物中黃酮糖苷類化合物有11種，其中，野漆樹苷、槲皮素3-O-（6-O-丙二?；?β-D-葡萄糖苷、山奈苷、水仙苷、芹菜素7-O-新橘皮糖苷、曲克蘆丁的含量隨陳化時間延長呈增加趨勢。茶葉中的多酚類物質主要包括兒茶素、黃酮及其糖苷等，是茶葉中主要的水溶性成分，兒茶素類是茶葉中重要的多酚類物質，其化合性質活潑，在常溫常壓下能夠緩慢氧化，氧化產生多酚類物質經一系列化學反應，生成一些對茶葉的滋味產生影響的物質[32]。

嘌呤類化合物與茶葉的苦澀味相關，且對茶葉適制性有重要影響。不同陳化時間老鷹茶樣本中嘌呤和嘌呤衍生物為次黃嘌呤和7-甲基黃嘌呤，兩者均為嘌呤生物堿，是茶葉苦味的主要來源[33]。隨陳化時間延長，其含量均降低，陳化能夠一定程度的降低茶葉中的苦味成分。

綜上，老鷹茶陳化過程中，老鷹茶中鮮味成分含量增加、苦澀味相關成分物質含量降低，抗氧化成分及其他保健功能性成分增加。故認為老鷹茶的滋味和營養成分能夠通過陳化改善，即陳化將增加老鷹茶及其茶湯的滋味和營養價值。

3 結論

基于UPLC-QTOF-MS非靶向代謝組學技術分析未陳化、陳化1年、2年和3年的老鷹茶代謝物，結合主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）法對代謝物進行分析。結果表明，共注釋到4 530個代謝物，以VIP≥1且P＜0.05為篩選標準篩選差異顯著代謝物，隨著陳化老鷹茶樣本中差異顯著代謝物數量逐漸上升，且上調代謝物在數目占優勢。陳化在一定程度上會提高老鷹茶滋味，經過陳化的老鷹茶中與鮮味相關的L-天冬氨酸含量顯著提高，苦味物質次黃嘌呤和7-甲基黃嘌呤顯著降低，具有抗氧化作用、降血糖潛力、抗腫瘤功效的黃酮類化合物顯著增加。綜合來看，老鷹茶陳化過程中鮮味成分含量增加、苦澀味相關成分物質降低，抗氧化及其他保健功能性成分增加。本研究為進一步為解析老鷹茶陳化過程中代謝機制奠定理論基礎。