桃金娘果酒酵母菌的篩選鑒定及生長特性分析

趙廣河，胡夢琪，陸璽文，趙豐麗

（1.廣西師范大學 生命科學學院 廣西漓江流域景觀資源保育與可持續利用重點實驗室 珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004；2.廣西師范大學 應用生物學研究所，廣西 桂林 541004）

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）是桃金娘科桃金娘屬常綠小灌木，原產于南亞和東南亞，主要分布于印度、中國的華東及華南、馬來西亞和蘇拉威西島（印度尼西亞）的南部[1]。桃金娘果實不僅營養豐富，還含有多酚、多糖、β-胡蘿卜素等生物活性物質，其中白皮杉醇含量高達2.3 mg/g干質量，是紅葡萄的1 000～2 000倍[2-3]，具有抗炎[4]、抗氧化[5-7]、抗動脈粥樣硬化[8]、抑菌[9]、抗過敏[9]、抗腫瘤[10]等生理功效。桃金娘果實藥用歷史悠久，可用于補血、滋養、安胎及病后體虛、神經衰弱、耳鳴和遺精等方面。

桃金娘果實加工成的發酵型飲料“Ruou Sim”在越南南部和中部地區頗受歡迎[11]。我國部分地區采用自然發酵法制作桃金娘果酒。然而，上述方法所制桃金娘果酒口感微澀、品質不穩定。酵母是果酒發酵的關鍵，性能優良的酵母菌不僅可以縮短果酒發酵時間、提高果酒品質，還可以較好地保持果實自身的風味特性。近年來，研究者采用接種某名牌商用釀酒酵母發酵制備桃金娘果酒[12-14]。然而，果酒風味較為淡薄，無法滿足消費者的口味需求。因此，尋找適宜的桃金娘果酒發酵專用酵母成了開發優質桃金娘果酒的關鍵所在。

本研究從桃金娘葉片、根部土壤、果皮、果實自然發酵液中分離酵母菌，通過WL鑒定培養基分離、純化菌株，結合2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）顯色初篩、發酵性能測試復篩釀酒酵母，通過形態學觀察及26S rDNA基因序列分析對其進行鑒定，并對其耐受性進行分析，以期為后續優質桃金娘果酒的開發提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料桃金娘新鮮葉片、根部土壤、果皮、果實：于2020年10月采集自廣西賀州市某桃金娘果園。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖、氯化鈣、氯化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸二氫鉀、偏重亞硫酸鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose agar，YPD）培養基：將10 g酵母粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖溶于1 L純凈水，115 ℃滅菌20 min。在滅菌后的YPD液體培養基中加入20 g無菌瓊脂粉，搖勻、凝固后即為YPD固體培養基。

WL鑒定培養基：將4 g酵母粉、5 g胰蛋白胨、50 g葡萄糖、0.55 g磷酸二氫鉀、0.425 g氯化鉀、0.125 g氯化鈣、0.125 g硫酸鎂、0.002 5 g氯化鐵、0.002 5 g硫酸錳、22 mg嗅甲酚綠、20 g瓊脂溶于1 L純凈水，調整pH值為6.5，121 ℃滅菌15 min。

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）下層培養基：將10 g葡萄糖、1.5 g酵母粉、1 g磷酸二氫鉀、20 g瓊脂、0.4 g硫酸鎂、2 g蛋白胨，溶于1 L純凈水，調整pH值為5.5，115 ℃滅菌20 min。TTC上層培養基：將5 g葡萄糖、0.5 g紅四氮唑、15 g瓊脂溶于1 L純凈水，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

YM75型立式壓力滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；BX63型顯微鏡：日本Olympus公司；ABI3730XL測序儀：美國Applied Biosystems公司；Mini Pro 300V電泳儀：上海力申科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母的分離與純化

分別稱取新鮮桃金娘葉片、桃金娘根部土壤5 g，加入50 mL無菌水，置于28 ℃、150 r/min搖床培養3 h；稱取新鮮桃金娘果皮20 g于200 mL YPD液體培養基中，25 ℃條件下搖床（150 r/min）培養2 d；稱取新鮮桃金娘果實200 g充分破碎（過40目篩），加入適量葡萄糖將糖度調整為25°Bx，置于恒溫培養箱中25 ℃靜置發酵7 d。采用無菌水將上述菌懸液稀釋至10-1～10-5倍后，分別吸取100 μL各梯度稀釋液涂布于WL鑒定培養基，置于28 ℃恒溫培養箱中培養2～5 d。采用平板劃線法進行純化。

1.3.2 釀酒酵母的形態觀察及TTC培養基初篩

挑取表面光滑濕潤、中間隆起的具有典型酵母菌株形態特征的單菌落繼續培養，隨后將酵母菌株劃線接種于WL鑒定培養基，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]，觀察其菌落形態，并用無菌水稀釋菌懸液，通過顯微鏡觀察其細胞形態特征。挑選出特征明顯的菌落于YPD固體培養基劃線分離，挑選出單菌落，劃線于YPD固體斜面，28 ℃恒溫培養3 d，將單菌落劃線接種于TTC下層培養基，28 ℃恒溫靜置培養2～4 d；待菌落成型后，倒入TTC上層培養基，28 ℃避光培養2～3 h；3 h后通過觀察TTC培養基上菌落的顯色反應，TTC會在活酵母細胞中脫氫酶的催化作用下轉化為三苯甲臜，且呈紅色[16]。通過顏色深淺可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，從而判斷酵母菌產酒精能力的高低。篩選顏色較深的菌株接種于YPD斜面培養基上，在28 ℃培養箱中培養48 h后置于4 ℃保存，用于后續實驗。

1.3.3 釀酒酵母發酵性能測試

將初篩酵母菌接種于YPD斜面培養基上，在28 ℃培養箱中培養48 h，隨后將其再次接種于YPD斜面培養基上，在28 ℃培養箱中培養48 h，充分活化菌株；接著將酵母菌接種于YPD液體培養基中，置于28 ℃、150 r/min搖床培養3 d，制成菌懸液，按照2%（V/V）接種量接種于放置有倒置杜氏小管的20 mL YPD液體培養基中，28 ℃靜置培養3 d。在這期間，觀察記錄杜氏小管的產氣情況。

1.3.4 產酒精能力測試

將復篩菌株接種于YPD液體培養基，置于28℃、150r/min搖床培養3 d。按照2%（V/V）接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL的YPD液體培養基中，28 ℃恒溫培養5 d。量取100 mL發酵液置于500 mL圓底燒瓶中，再向該燒瓶中加入100 mL水，置于45 ℃旋轉蒸發儀中進行蒸餾，收集約96 mL餾出液，取下收集瓶冷卻至20 ℃，定容至100 mL，通過酒精計測其酒精度。

1.3.5 菌株的分子生物學鑒定

將篩選出來產酒精能力強的酵母菌株進行26S rDNA序列鑒定。DNA提取：按SK8257（酵母）試劑盒操作說明書提取酵母菌菌株的DNA。利用酵母菌引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）對菌株進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增體系（25 μL）：DNA模板（40 ng/μL）0.5 μL、10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2.0 μL、聚合酶0.2 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，加雙蒸水補充至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃修復延伸10 min，4 ℃終止反應。將擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）同源性搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA基因序列，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建菌株系統發育樹。

1.3.6 菌株生長及耐受性能分析

（1）生長曲線

分別將鑒定菌株接種于YPD液體培養基，置于28 ℃、150 r/min搖床培養3 d，獲得篩選菌株種子液，按照2%（V/V）的接種量接種于已滅菌的YPD液體培養基中，28 ℃恒溫培養32 h，每隔2 h無菌取樣，測其波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。每個試驗重復3次。

（2）耐受性能評價

參照梁裕崴[17]的方法并進行調整，將鑒定菌株制成菌懸液，按照2%（V/V）的接種量分別接種到不同pH值（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）、溫度（33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃）、葡萄糖含量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、酒精度（8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol）、SO2含量（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L）的YPD液體培養基中，以未經上述處理的YPD液體培養基為對照，28 ℃恒溫培養箱培養3 d，分別考察發酵24 h、48 h和72 h的產氣能力。每個試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母的分離、形態學觀察及TTC培養基初篩

桃金娘葉片、根部土壤、果皮、果實經WL鑒定培養基分離純化，共分離篩選得到45株菌株，依次命名為T1～T45。結合形態學觀察發現，菌株T3、T6、T7、T8、T11、T27、T29、T30、T32、T33、T35、T38、T39、T41、T43這15株菌株不符合酵母形態特征，故排除。剩余30株菌株菌落呈圓形或橢圓形，表面濕潤、光滑、有凸起，大小不一，具有典型的酵母菌形態特征。其中，代表菌株T2（篩選自果皮）的菌落及細胞形態見圖1。由圖1可知，菌株T2呈綠色、圓形、中間凸起、無褶皺、光滑、濕潤；菌體形態無色透明、橢圓、出芽生殖。

采用TTC顯色法對上述30株菌株進行初篩。不顯色的菌株有2株，為菌株T34、T37，其他28株菌株（編號分別為T1、T2、T4、T5、T9、T10、T12、T13、T14、T15、T16、T17、T18、T19、T20、T21、T22、T23、T24、T25、T26、T28、T31、T36、T40、T42、T44、T45）均呈紅色，因此，選取這28株菌株用于后續杜氏小管產氣試驗。

2.2 釀酒酵母發酵性能測試

2.2.1 杜氏小管產氣法復篩

酵母菌分解糖產生二氧化碳[18]，菌株的發酵能力與產氣情況呈正比，產氣速度越快、產氣量越大，則發酵能力越強。28株菌株的杜氏小管產氣法復篩結果見表1。由表1可知，菌株T10、T14、T15等14株菌株在48 h內均不產氣，說明這些菌株為非酵母菌株，可排除。菌株T19在24 h內不產氣，在48 h內所產氣體僅能充滿杜氏管體積的1/3，產氣能力較差。菌株T1、T2、T4等13株菌株在48h內所產氣體可以將杜氏小管充滿，其中，菌株T2、T13、T16、T23、T25、T36均可在24 h內充滿氣體，而其他7株菌在24 h內僅產生1/3或2/3氣體。將48 h內杜氏管能產氣的14株菌株用于后續產酒精能力試驗。

表1 28株篩選菌株的杜氏小管產氣法復篩結果Table 1 Rescreening results of 28 screened strains by Duchenne tube gas production method

2.2.2 篩選菌株產酒精能力測定

篩選菌株產酒精能力測定結果見表2。由表2可知，菌株T2、T19發酵液的酒精度最高，均為2.5%vol，其他菌株發酵液的酒精度為1.5%vol～2.0%vol。因此，選擇菌株T2、T19進行分子生物學鑒定。

表2 篩選菌株產酒精能力測定結果Table 2 Determination results of alcohol production capacity of screened strains

2.3 篩選菌株的分子生物學鑒定

將菌株T2、T19進行26S rDNA分子生物學鑒定，構建其系統發育樹，結果見圖2。由圖2（A）可知，菌株T2與仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）聚于一支，同源性達100%。因此，菌株T2被鑒定為仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）。由圖2（B）可知，菌株T19與長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）聚于一支，同源性達100%，將菌株T19被鑒定為長孢洛德酵母（Lodderomyc eselongisporus）。

圖2 基于26S rDNA基因序列菌株T2（A）和T19（B）的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains T2 (A) and T19 (B) based on 26S rDNA gene sequences

2.4 篩選菌株的生長曲線

菌株T2和T19的生長曲線見圖3。

圖3 菌株T2和T19的生長曲線Fig.3 Growth curves of strains T2 and T19

由圖3可知，菌株T2和T19生長趨勢基本一致。發酵時間為0～2 h時，菌株T2生長緩慢，為遲滯期；發酵時間為2～8 h時，菌株快速增殖，為對數生長期；發酵時間＞8 h后菌株T2生長趨勢較平緩，進入穩定期。菌株T19在0～2 h內生長緩慢，為遲滯期；在2～12 h內快速增長，為對數生長期；發酵時間＞12 h后菌株T19呈緩慢增長趨勢，進入穩定期。因此，2株酵母菌在12～32 h范圍內生長良好。

2.5 篩選菌株耐受性實驗

2.5.1 pH耐受性

篩選菌株的pH值耐受性實驗結果見表3。在pH＜3.0時，菌株T2在24 h內的產氣受到抑制。在pH值≤2.0時，菌株T2在24 h內不產氣，而在pH值為2.0～4.5時，可使杜氏小管在48 h內充滿氣體，在pH值為1.5～4.5時，可使杜氏小管在72 h內充滿氣體。在pH值為1.5～4.5條件下，菌株T19在48 h內均不產氣，而在pH值為4.0～4.5時，可使杜氏小管在72 h內充滿氣體。因此，菌株T2對pH值耐受性能優于菌株T19，具有較強的耐酸性。

表3 篩選菌株的pH值耐受性實驗結果Table 3 Results of pH tolerance tests of screened strains

2.5.2 溫度耐受性

溫度不僅影響酵母菌對營養物質的代謝轉化，而且影響其發酵產物的整體風味[19]。篩選菌株的溫度耐受性實驗結果見表4。由表4可知，溫度為33～36 ℃時，菌株T2可使杜氏小管在48h內充滿氣體，而菌株T19可使杜氏小管在72 h內充滿氣體。因此，菌株T2溫度耐受性優于菌株T19。

表4 篩選菌株的溫度耐受性實驗結果Table 4 Results of temperature tolerance tests of screened strains

2.5.3 葡萄糖耐受性

篩選菌株的葡萄糖耐受性實驗結果見表5。在葡萄糖含量＞30%時，菌株T2在24 h內的產氣受到抑制。在葡萄糖含量為10%～30%，菌株T2可使杜氏小管在48 h內充滿氣體，而在葡萄糖含量為10%～60%，可使杜氏小管在72 h內充滿氣體。在葡萄糖含量為10%～40%時，菌株T19可使杜氏小管在72 h內充滿氣體，但48 h內均不產氣。上述結果與管慶林等[20-21]的研究結果一致，因為高濃度葡萄糖溶液所形成的高滲透壓環境導致酵母菌細胞破裂、水分流失從而抑制了酵母菌的生長[22]。因此，菌株T2的葡萄糖耐受性能優于菌株T19。

表5 篩選菌株的葡萄糖耐受性實驗結果Table 5 Results of glucose tolerance tests of screened strains

2.5.4 酒精耐受性

醇類會影響酵母菌的相關膜及代謝通道的穩定性、糖代謝能力從而阻礙酵母菌的生長[23-24]。篩選菌株的酒精耐受性實驗結果見表6。由表6可知，菌株T2在酒精度8%vol～10%vol條件下僅在48 h內有產生少量氣體產生，在其他酒精度條件下均不產氣；而菌株T19在酒精度8%vol～18%vol條件下在72 h內均不產氣。因此，菌株T2對酒精耐受能力略優于菌株T19，但兩者對酒精耐受能力均較弱，更適合應用于低醇飲品的生產。

表6 篩選菌株酒精耐受性實驗結果Table 6 Results of alcohol tolerance tests of screened strains

2.5.5 SO2耐受性

SO2在果酒發酵過程中不僅可以提高有機酸含量、降低揮發酸含量，而且可以有效抑制細菌的生長繁殖[25]。篩選菌株SO2耐受性實驗結果見表7。在SO2質量濃度＞200 mg/L時，菌株T2在24 h內的產氣受到抑制，而在SO2質量濃度為100～350 mg/L時，可使杜氏小管在48 h內充滿氣體。在SO2質量濃度為100～350 mg/L時，使菌株T19在48 h內的產氣均受不同程度的抑制，但可使杜氏小管在72 h內充滿氣體。因此，菌株T2的SO2耐受性優于菌株T19。

表7 篩選菌株的SO2耐受性實驗結果Table 7 Results of SO2 tolerance tests of screened strains

3 結論

本研究以桃金娘葉片、根部土壤、果皮、果實為實驗材料，通過WL鑒定培養基純化、TTC顯色初篩和發酵性能測試復篩篩選出兩株酵母菌T2、T19。經26S rDNA序列分析，將菌株T2和T19分別鑒定為仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）和長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus），均為非釀酒酵母。耐受性試驗結果顯示，菌株T2的耐受性能優于T9，菌株T2可耐受pH、葡萄糖含量和SO2含量分別為3.0、30%和200 mg/L。本研究結果可為優質桃金娘果酒的開發提供理論和技術支持。