產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的分離鑒定、高溫馴化及酶學性質(zhì)研究

張 璋，趙騰飛，李紅霞，胡智慧，宋露露

（茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507）

白酒是中國傳統(tǒng)的酒精飲料，是世界上最古老的蒸餾酒之一[1-2]，以獨特的風味在中國倍受推崇，也逐漸受到世界各地的關(guān)注和歡迎。白酒生產(chǎn)包括大曲制作、發(fā)酵、蒸餾和陳釀[1，3-4]。大曲是白酒發(fā)酵重要的發(fā)酵劑和糖化劑，主要含有各種微生物及其所分泌的多種水解酶系[5-8]。在繁雜的水解酶系中，淀粉酶能夠?qū)⒌矸鬯獠⒆罱K產(chǎn)生寡糖單元，廣泛應(yīng)用于酒精、食品、醫(yī)藥、化工、造紙和紡織等行業(yè)當中，是最為重要的工業(yè)酶制劑之一。淀粉酶由多種細菌、霉菌等微生物產(chǎn)生。在大曲尤其是醬香型白酒的高溫大曲中，芽孢桿菌作為優(yōu)勢細菌，更是生產(chǎn)淀粉酶的主力菌種。

在針對芽孢桿菌淀粉酶研究與開發(fā)進程中，學者們重點針對淀粉酶產(chǎn)生菌、基因特征、表達方式、酶學性質(zhì)改造、生產(chǎn)工藝優(yōu)化等方面進行了研究，取得了大量的研究成果[9-12]。但是針對工業(yè)應(yīng)用多種多樣的需求來說，如醬香型白酒的高溫釀造環(huán)境或者利用低溫蒸煮生米作為碳源進行谷胱甘肽的發(fā)酵[13-14]等，篩選具有廣泛適用性的菌種及對其產(chǎn)酶能力的研究仍在進行之中。如貝萊斯芽孢桿菌淀粉酶定點突變后其穩(wěn)定性有所增加，但在70 ℃條件下保溫30 min時活性僅殘余20%左右[15]。地衣芽孢桿菌淀粉酶耐熱突變后，最適反應(yīng)溫度提高了10 ℃，但是適用溫度范圍較小，在60 ℃以下反應(yīng)僅能保持40%左右的活性[16]，針對不同工業(yè)的普適性應(yīng)用仍舊有一定的局限。地衣芽孢桿菌淀粉酶經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)后酶活提高到7.9 U/mL[17]，仍遠遠不能滿足工業(yè)生產(chǎn)對高活性淀粉酶的需求。

本研究從醬香型高溫大曲中對芽孢桿菌進行分離篩選，結(jié)合菌株形態(tài)學觀察以及16S rDNA序列測定對菌株種屬來源進行鑒定，并以淀粉酶活力作為評價指標，針對高溫馴化前后菌株所產(chǎn)淀粉酶的酶學性質(zhì)進行探討，以研究高溫馴化對菌株生長及其所產(chǎn)淀粉酶酶活的影響以及其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬香型白酒大曲樣品：貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)某酒廠。

1.1.2 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、PCR預(yù)混液：生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸氫鈉、苯酚、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基[18]：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L、可溶性淀粉20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基[18]：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9402型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；BSD-YX3200型立式智能精密搖床：上海博訊實業(yè)有限公司；JNOEC XS-212-202型電子顯微鏡：上海圓派科學儀器有限公司；FA2004N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；UV-5100型紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；SIGMA-1-14型低溫離心機：美國Sigma-Aldrich公司；S1000TM型PCR擴增儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的富集與分離[18]

稱取1 g醬香型白酒大曲樣品，加入10 mL生理鹽水混勻，置于80 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，每隔2 min振蕩混勻。水浴結(jié)束后取上清液用生理鹽水進行梯度稀釋。分別選取10-5、10-6、10-7、10-8濃度，以四區(qū)劃線法接種至固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。使用盧戈氏碘液染色后觀察篩選平板上單菌落的透明水解圈，并比較透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值（D/d），挑取比值大的菌落進行復篩。

1.3.2 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的復篩

將挑取的菌落接種于液體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)16 h制備種子液。將種子液稀釋至OD600nm值為0.6，按照2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基搖瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。在不同時間點取樣，12 000 r/min離心收集發(fā)酵上清液。測定發(fā)酵上清液中淀粉酶的活力，篩選淀粉酶活性高的菌株。

1.3.3 淀粉酶活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[19]測淀粉酶活性。酶活單位定義：1 mL粗酶液在40 ℃條件下，1 min水解淀粉生成1 μg葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活單位，U。

1.3.4 菌株的形態(tài)觀察及分子生物學鑒定

將菌株接種至固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h后進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征。

采用苯酚氯仿抽提法[20]對目標菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行提取。并以此DNA為模板，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA的擴增。PCR擴增體系：DNA模板0.5 μL，27F和1492R各2 μL，PCR預(yù)混液補足50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對，比對結(jié)果使用MEGA 11.0生物學軟件進行比對分析，并利用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21-22]，確定菌株的種屬。

1.3.5 芽孢桿菌的高溫馴化

將篩選得到的菌株在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)16 h后，以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，分別于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、24 h時測定菌液在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）、酶活力，每個時間點測定3次，繪制芽孢桿菌在不同溫度條件下的生長曲線和所產(chǎn)淀粉酶的酶活力曲線，并確定馴化點溫度。

以馴化點溫度將菌株培養(yǎng)至OD600nm值達到0.6時，以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入高于馴化點2.5 ℃的搖瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600nm值達到0.6時再以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入高于馴化點5 ℃的搖瓶內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、24 h時測定菌液在波長600 nm處的吸光度值、酶活力，每個時間點測定3次，繪制芽孢桿菌在不同溫度條件下的生長曲線和所產(chǎn)淀粉酶的酶活力曲線。

1.3.6 淀粉酶的酶學性質(zhì)[15-16]

pH對淀粉酶活力的影響：將底物用不同pH值（1、2、3、4、5、6、7、8、9）的緩沖液溶解，測定淀粉酶活力，考察pH對淀粉酶活力的影響，以最高酶活設(shè)為100%，計算相對酶活。

淀粉酶的pH穩(wěn)定性：將酶液用最適pH值緩沖液稀釋后，在不同的時間點進行取樣，然后在最適反應(yīng)pH條件下測殘余酶活。

溫度對淀粉酶活力的影響：按照酶活力測定的方法，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下測淀粉酶的活力，考察溫度對淀粉酶活力的影響。

淀粉酶的溫度穩(wěn)定性：將酶液在最適溫度條件下保溫，在不同的時間點進行取樣，然后在最適反應(yīng)溫度條件下測殘余酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選

以菌落的透明水解圈為依據(jù)進行初篩，從醬香型白酒大曲中分離得到純培養(yǎng)菌株350株，其中產(chǎn)淀粉酶水解透明圈的菌株12株，菌落直徑及透明圈直徑比值見表1。由表1可知，5號菌株、10號菌株和11號菌株的D/d值最高，且5號＞10號＞11號，因此選擇這3株均進行復篩。

表1 篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的透明水解圈及菌落直徑比值Table 1 Ratio of transparent hydrolytic circle and colony diameter of screened amylase-producing strains

對5號、10號、11號菌株進行搖瓶培養(yǎng)，并分別對其所產(chǎn)淀粉酶進行活性測定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，5號菌株產(chǎn)酶酶活在前6 h上升較為平緩，在6～10 h顯著上升，10～12 h變化不大，均處于較高水平，在10 h時具有最高酶活332.4 U/mL，12 h后活性有較為明顯的下降，24 h時降至最高酶活的21%。10號菌株酶活變化情況與5號菌株相似，在培養(yǎng)10 h時達到最高酶活252.4 U/mL。11號菌株活性總體較低，在12 h處達到最高酶活114.0 U/mL，之后活性快速下降。3個菌株的淀粉酶活力存在較為明顯的差異，其活性排列順序和D/d值保持一致，選擇5號菌株為目標菌株進行后續(xù)研究，并命名為菌株AmyZ5。不同的菌株具有各異的遺傳特性，從而表現(xiàn)出不同的生物活性特征，也正是由于這些催化風格各異的微生物種群之間的微妙平衡和相互結(jié)合，才呈現(xiàn)出了各具特色的釀造工藝及風格迥異的白酒產(chǎn)品[23]。

圖1 篩選菌株產(chǎn)淀粉酶活性對比Fig.1 Comparison of amylase activities produced by screened stains

2.2 菌株AmyZ5的種屬鑒定

2.2.1 菌株AmyZ5的形態(tài)特征

菌株AmyZ5在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征和革蘭氏染色后細胞的形態(tài)特征見圖2。由圖2A可知，菌株AmyZ5在固體培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)淡黃色不透明狀態(tài)，邊緣無規(guī)則不平滑，菌落內(nèi)部濕潤且不易被挑起。由圖2B可知，菌株AmyZ5的細胞形態(tài)為桿狀，單細胞，或多細胞首尾相連呈鏈狀排列，可形成橢圓形的芽孢。根據(jù)菌株AmyZ5的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)，初步判定菌株AmyZ5為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株AmyZ5的菌落（A）和細胞（B）形態(tài)特征Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphological characteristics of strain AmyZ5

2.2.2 菌株AmyZ5的分子生物學鑒定

對擴增得到的16S rDNA序列測序，將測序結(jié)果進行BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株AmyZ5與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）XC1的16S rDNA具有最高的序列同源性。利用MEGA 11.0[21]生物學軟件分析菌株AmyZ5和相關(guān)菌株的16S rDNA基因，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株AmyZ5的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain AmyZ5 based on 16S rDNA gene sequence

由圖3可知，菌株AmyZ5與Bacillus velezensis同屬一個分支，綜合菌落形態(tài)、細胞形態(tài)和分子生物學結(jié)果，鑒定菌株AmyZ5為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.3 菌株AmyZ5的高溫馴化

2.3.1 菌株AmyZ5在不同溫度下的生長情況及酶活力變化

醬香型白酒高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵的生產(chǎn)工藝對菌株的生長代謝有較大的影響[24]。由圖4A可知，菌株AmyZ5在30～45 ℃條件下均能夠生長，但在45 ℃條件下生長量具有較為明顯的下降，30 ℃條件下培養(yǎng)15 h菌液OD600nm值是45 ℃時的1.4倍。由圖4B可知，雖然菌株AmyZ5能夠在較高溫度條件下保持生長，但其所產(chǎn)淀粉酶活性則隨溫度的升高而持續(xù)降低。不同培養(yǎng)溫度下，淀粉酶最高活性均出現(xiàn)在培養(yǎng)15 h時，但45 ℃時菌株AmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性約為30 ℃時的1/3。芽孢桿菌相比較其他菌種而言，因其較高的耐溫性，是高溫大曲中的優(yōu)勢細菌。雖然芽孢桿菌能夠在較高的溫度下存活，但其生物活性相較于最適生長溫度來說，會被高溫環(huán)境所抑制，這對于發(fā)酵原料的利用及白酒風味物質(zhì)的產(chǎn)生有著嚴重的影響。

圖4 不同溫度條件下菌株AmyZ5的生長情況（A）及淀粉酶活（B）Fig.4 Growth (A) and amylase activities (B) of strain AmyZ5 under different temperature conditions

2.3.2 菌株AmyZ5高溫馴化后的生長情況及酶活力變化

為提高菌株AmyZ5在45 ℃時的生長活力，對其進行高溫馴化。培養(yǎng)環(huán)境溫度的急劇改變，不利于菌種對于環(huán)境的適應(yīng)，從而延長適應(yīng)期并可能導致菌種生長量的降低。因此采用梯度升溫的方式對菌株AmyZ5進行馴化，將馴化后的菌株命名為HTAmyZ5。

由圖5A可知，經(jīng)過馴化，菌株HTAmyZ5在45 ℃條件下培養(yǎng)24 h的OD600nm值是馴化前培養(yǎng)24 h的OD600nm值的1.3倍，更為顯著的是對于高溫環(huán)境適應(yīng)的時間大大縮短。馴化前菌株AmyZ5在前9 h時生長十分緩慢，而高溫馴化后3 h時OD600nm值是馴化前培養(yǎng)3 h時OD600nm值的4.2倍。不僅僅是生長量有了明顯的提高，馴化后菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶的酶活也得到了顯著的提高。由圖5B可知，馴化后菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶在9 h時出現(xiàn)最大酶活196.1 U/mL，在12 h時酶活仍保持在97%，在24 h時酶活存留約70%左右。高溫馴化后，最高淀粉酶活性（培養(yǎng)10 h時）是馴化前（培養(yǎng)15 h時）的1.9倍。較短的適應(yīng)期以及較高的生長量和淀粉酶活性，不僅能夠提高釀酒原料的利用和轉(zhuǎn)化，還可以大大縮短釀造所用的時間，對于白酒發(fā)酵生產(chǎn)具有著積極的意義。

圖5 高溫馴化前后菌株AmyZ5的生長情況（A）及淀粉酶活（B）對比Fig.5 Comparison of growth (A) and amylase enzyme activities (B) of strain AmyZ5 before and after high temperature acclimation

2.4 菌株AmyZ5和HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的酶學性質(zhì)分析

2.4.1 菌株AmyZ5和HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的最適反應(yīng)條件

在醬香型白酒發(fā)酵工藝中，高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵是獨特工藝點及關(guān)鍵控制點[25]。而溫度、pH等環(huán)境因素對于酶的催化性質(zhì)也起著決定性的影響[26-27]。由圖6A可知，馴化后所產(chǎn)淀粉酶活性的最適反應(yīng)溫度從40 ℃提高至70 ℃，這對于醬香型白酒“三高”發(fā)酵工藝中原料的生物轉(zhuǎn)化有著十分有利的作用；同時，在20～90 ℃反應(yīng)溫度之間，相比較菌株AmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性迅速變化的情況而言，菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性均能保持在最高酶活的60%以上，這也為菌株HTAmyZ5淀粉酶提供了可觀的工業(yè)應(yīng)用前景[14，28]。由圖6B可知，高溫馴化并沒有改變該貝萊斯芽孢桿菌淀粉酶的最適反應(yīng)pH，在馴化前后均為pH 3。但菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶在pH 1～9時活性變化較小，在pH 1～7時活性能夠保持在60%以上，在pH9時仍能保持在40%左右。與菌株AmyZ5僅在pH 2～5范圍內(nèi)保持60%以上活性相比，菌株HTAmyZ5在反應(yīng)溫度及pH值的適用范圍更為廣泛，具有巨大的實際應(yīng)用潛能。在最適反應(yīng)條件下，菌株HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性達到322.1 U/mL，為45 ℃培養(yǎng)條件時菌株AmyZ5所產(chǎn)淀粉酶活性的3.1倍。有文獻報道稱，不同的培養(yǎng)溫度對芽孢桿菌分泌淀粉酶的活性有明顯影響[29]。菌株HTAmyZ5經(jīng)過耐高溫馴化后，可能由于逐漸升高的培養(yǎng)溫度誘導菌株分泌的淀粉酶中耐高溫淀粉酶所占比例增加，從而體現(xiàn)為所產(chǎn)淀粉酶的反應(yīng)溫度有所提高。后續(xù)會對淀粉酶進行進一步的分離純化，并調(diào)取基因組中相關(guān)基因進行異源表達，以研究馴化后淀粉酶最適反應(yīng)溫度發(fā)生改變的相關(guān)機理。

圖6 菌株AmyZ5和HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度（A）及pH（B）Fig.6 Optimum reaction temperature (A) and pH (B）of crude enzyme solution of amylase produced by strains AmyZ5 and HTAmyZ5

2.4.2 菌株AmyZ5/HTAmyZ5產(chǎn)淀粉酶粗酶液的穩(wěn)定性分析

淀粉酶在最適反應(yīng)溫度及pH條件下的穩(wěn)定性也決定著其在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)當中的應(yīng)用效果。由圖7A可知，高溫馴化對淀粉酶在其最適反應(yīng)溫度條件下的穩(wěn)定性有著較小幅度的降低，2 h時菌株HTAmyZ5淀粉酶酶活殘余22.2%，相比較菌株AmyZ5淀粉酶的殘余酶活下降了36%。持續(xù)較高的溫度對蛋白質(zhì)構(gòu)象有較大的影響[30]，這可能是引起菌株HTAmyZ5淀粉酶溫度穩(wěn)定性發(fā)生一定下降的原因。而pH穩(wěn)定性的變化要復雜一些。由圖7B可知，在較短的反應(yīng)時間（0.5 h）內(nèi)，菌株HTAmyZ5的pH穩(wěn)定性相比菌株AmyZ5要高；處于較長的反應(yīng)時間時，菌株HTAmyZ5的pH穩(wěn)定性則有所降低，但在2 h時兩者的殘余酶活十分接近。結(jié)合溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性分析，高溫馴化對于貝萊斯芽孢桿菌淀粉酶的穩(wěn)定性沒有產(chǎn)生顯著改變。

圖7 菌株AmyZ5和HTAmyZ5所產(chǎn)淀粉酶粗酶液的溫度（A）及pH（B）穩(wěn)定性Fig.7 Temperature (A) and pH (B) stability of crude enzyme solution of amylase produced by strains AmyZ5 and HTAmyZ5

3 結(jié)論

本研究首先利用透明圈法從醬香型高溫大曲中分離篩選到一株產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌，通過對其進行形態(tài)學觀察以及分子生物學鑒定，確定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），命名為AmyZ5。對其生長環(huán)境溫度耐受性進行分析后發(fā)現(xiàn)，菌株AmyZ5在30 ℃時具有較高的生長量；所產(chǎn)淀粉酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH為3。對AmyZ5菌株進行高溫馴化，馴化后菌株HTAmyZ5能夠在45 ℃環(huán)境下具有較高的生長量，同時大大縮短菌種在高溫環(huán)境的適應(yīng)期，培養(yǎng)3 h時OD600nm值比菌株AmyZ5提高了4.2倍；其所產(chǎn)淀粉酶最適反應(yīng)溫度提高到70 ℃，在20～90 ℃范圍內(nèi)活性能夠保持在60%以上；最適反應(yīng)pH仍為3，在pH 1～7范圍內(nèi)活性能夠保持在60%以上，在pH 9時仍保留有40%的活性；最高酶活提高了3.1倍，達到322.1 U/mL；穩(wěn)定性受到高溫培養(yǎng)環(huán)境的影響有小幅度的降低，但變化并不顯著。本試驗馴化得到的芽孢桿菌在較高溫度環(huán)境下能夠持續(xù)生長并分泌較高活性的淀粉酶，對醬香型白酒發(fā)酵高溫生產(chǎn)工藝具有較好的適用潛力及潛在的工業(yè)應(yīng)用價值，同時為該菌株在白酒發(fā)酵乃至酒糟降解等工業(yè)應(yīng)用方面奠定了一定的科學依據(jù)及理論基礎(chǔ)。后續(xù)將針對該菌種的傳代穩(wěn)定性、所產(chǎn)淀粉酶的基因工程菌異源表達以及淀粉酶結(jié)構(gòu)改造進行更深入的研究。