六妹羊肚菌原生質體單核化再生菌株的雜交分析

劉 彬，周伏忠*，刁文濤，陳曉飛，郭 恒，寧 萌

（河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008）

羊肚菌（Morchella sextelata）隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota）、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）[1-3]，是世界四大珍貴食用菌之一。羊肚菌富含氨基酸、多糖、礦質元素等多種營養成分，而且具有增強免疫力、抗菌、抗腫瘤、保護心血管等功效[4-5]。目前我國羊肚菌栽培面積已超過8 000 hm2且仍在不斷增加，然而每年仍有50%～70%的種植者無法穩定盈利、重返貧困或負債[6-7]。其中，羊肚菌菌種易老化退化（如交配型丟失、線粒體功能衰退等）、產量不穩定等成為制約我國羊肚菌產業健康穩定發展的關鍵因素[8-10]。

羊肚菌菌絲細胞是一種異宗結合的多核菌絲體，每個細胞含有15～42個細胞核，每個細胞核含有一種交配型，其子囊孢子也為多核，每個孢子含有18～32個細胞核[11-13]，這些情況十分不利于羊肚菌遺傳育種工作的開展。原生質體單核化技術在大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata）[14]、香菇（Lentinus edodes）[15-17]、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）[18]、真姬菇[19]、阿魏菇[20]、平菇[21]、靈芝[22]、玉木耳[23]等擔子菌的單交配型菌株的分離和遺傳育種研究中得到廣泛應用并取得良好效果；而子囊菌類食藥用菌的原生質體單核化菌株的分離和雜交育種研究報道較少，如蛹蟲草（Cordyceps militaris）[24]、梯棱羊肚菌（Morchella importuna）[25-26]等；LIU W等[25]利用原生質體單細胞技術分離到梯棱羊肚菌的單交配型同核體，賀國強[26]利用梯棱羊肚菌的單交配型子囊孢子進行雜交試驗成功得到雜交菌株，目前還沒有看到利用原生質體單核化再生菌株進行六妹羊肚菌雜交育種的研究報道。

本研究在對六妹羊肚菌（Morchella sextelata）原生質體單核化再生菌株的分離、交配型鑒定的基礎上，對單交配型再生菌株進行對峙培養雜交實驗制備雜交菌株，以菌株生長勢、抗鞣酸能力和菌核產生能力為技術指標，對單核化再生菌株及雜交菌株的多態性進行分析，并對雜交菌株的交配型進行檢測，以期探索六妹羊肚菌原生質體再生菌株雜交的科學性和可行性，為六妹羊肚菌的雜交育種工作提供新技術路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與引物

70株單交配型六妹羊肚菌：河南省科學院生物研究所有限責任公司微生物工程重點實驗室通過原生質體單核化技術分離保存的單交配型菌株[27]，其中部分菌株為紫外線（ultraviolet，UV）（編號帶“UV”的菌株）或亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）（編號帶“5G”的菌株）誘變和原生質體單核化分離獲得的。交配型基因的上游引物（P6-1F、P8-4F）及下游引物（P6-1R、P8-4R）參照賀國強[26]的序列：由華大基因公司提供合成服務。其中引物對（P6-1F/P6-1R）用于檢測交配型MAT1-2-1基因，引物對（P8-4F/P8-4R）擴增交配型MAT1-1-1基因。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硝酸鈉、胰蛋白胨、酵母提取物（粉）、瓊脂糖、鞣酸、乙醇、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙酸鋰（均為分析純或生化試劑）：天津市致遠化學試劑有限公司；電泳緩沖液、GenSTAR Stain RED核酸染料：北京康潤誠業生物科技有限公司；2×ESTaqMaster Mix試劑盒：北京天根生化科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：上海萊楓生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

完全酵母提取物培養基（complete yeast extract medium，CYM）：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母粉0.1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.046%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂1.5%，蒸餾水配制，pH值自然。

土豆汁葡萄糖瓊脂（potato juice dextrose agar，PDA）培養基：將200 g土豆切片并煮沸10 min，3～4層紗布過濾；取濾液加入葡萄糖2%，瓊脂1.5%，蒸餾水定容至1 L，pH值自然。

PDA（鞣酸）培養基：在PDA培養基的基礎上，添加4 mmol/L鞣酸。

基本培養基（minimal medium，MM）：葡萄糖2%、硝酸鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、七水硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、碳酸鈣0.01%、硫酸亞鐵0.001%、硫酸鋅0.001%、硫酸銅0.001%、瓊脂1.5%，蒸餾水配制，pH值自然。

上述四種培養基均采用121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺：上海滬凈凈化設備有限公司；TCYQ型全溫搖瓶柜：太倉市豪誠公司；DDY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；ChemiDocTMXRS+化學發光凝膠成像系統：美國BIO-RAD公司；MIKRO 22R離心機：德國Hettich公司；Tpersonal聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：法國Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 原生質體單交配型再生菌株的多態性分析

選取實驗室保藏的35株六妹羊肚菌MAT1-1-1交配型原生質體再生菌株和35株六妹羊肚菌MAT1-2-1交配型原生質體再生菌株進行生長勢、抗鞣酸能力及菌核產生能力測定，目的是為后續雜交實驗提供菌株材料和分析數據。

1.3.2 原生質體單交配型再生菌株的對峙培養雜交

對六妹羊肚菌原生質體單交配型再生菌株進行對峙培養雜交，參照賀國強[26]的方法并有所修改：將單交配型斜面菌株轉接至PDA平板上23 ℃培養3～4 d后，用直徑10 mm無菌打孔器轉接1塊圓形菌絲塊至新PDA平板上進行對峙培養，菌絲塊之間距離約2.5 cm，23 ℃培養3～4 d；然后挑取兩個菌絲塊中間的菌絲（約2～3 mm2）至MM平板上培養3～4 d；再挑取菌落尖端幼嫩菌絲至新MM上，連續挑取3次；將第3次的菌落尖端菌絲轉接至CYM斜面上，23 ℃培養13～15 d，低溫保藏。

1.3.3 原生質體雜交菌株的多態性分析

對雜交菌株進行多態性分析，對其生長勢、抗鞣酸能力及菌核產生能力進行測定。

（1）生長勢的測定

將實驗菌株轉接至PDA平板上，23 ℃培養3～4 d；然后用直徑10 mm打孔器移取一塊圓形菌絲塊至PDA（鞣酸）培養基平板上，每個平板等距離放置三個菌絲塊，23～24 ℃培養15～16 d。采用精度1 mm的鋼尺測量每株菌的菌絲帶寬度（mm）。菌絲帶寬度（mm）=（菌落直徑-10）/2。

（2）抗鞣酸能力的測定

抗鞣酸能力一定程度上反映菌株的漆酶活性[28]。本實驗用褐變圈直徑反映菌株的抗鞣酸能力；用精度1 mm的鋼尺測量每株菌的褐變圈直徑（mm）。

（3）菌核產生能力的測定

菌核產生與否是羊肚菌菌絲生長階段的一個重要指標，本實驗觀察并比較了每株菌在CYM斜面上的菌核數量，共分為五個級別，由少到多依次為：“0”表示看不見菌核，“+”表示可見少量菌核，“++”表示菌核數量一般，“+++”表示菌核較多，“++++”表示菌核很多或只有菌核。

1.3.4 雜交菌株生長類型的測定

根據菌株在CYM斜面上的菌絲生長和菌核產生情況，將雜交菌株大致劃分為菌核型（sclerotia，S）、菌絲型（hyphae，H）和混合型（mixture of sclerotia and hyphae，M）三種生長類型：“菌核型（S）”表示斜面上有大量菌核產生或全部長滿菌核的類型；“菌絲型（H）”表示斜面上看不見菌核或只有少量菌核的情況；“混合型（M）”則表示斜面上菌絲和菌核均有生長、可見的中間類型。

1.3.5 雜交菌株的交配型測定

按照劉彬等[27]的方法測定雜交菌株的交配型，并根據檢測結果區分真雜交菌株或假雜交菌株。交配型電泳結果：“+”表示擴增出條帶，“-”表示沒有擴增出條帶。

2 結果與分析

2.1 原生質體單交配型再生菌株的多態性分析結果

35株六妹羊肚菌MAT1-1-1交配型原生質體再生菌株和35株MAT1-2-1交配型原生質體再生菌株在PDA（鞣酸）平板上的多態性進行分析，結果見表1。

表1 六妹羊肚菌原生質體單交配型再生菌株的多態性分析結果Table 1 Polymorphism analysis results of Morchella sextelata protoplast single mating type regeneration strains

由表1可知，褐變圈直徑與菌絲帶寬度二者之間呈正相關，褐變圈直徑越大、菌絲帶寬度也較大；單交配型交配型菌株MAT1-1-1、交配型菌株MAT1-2-1的菌絲帶寬度均為0～10 mm，表明其生長勢相近；菌株MAT1-1-1的褐變圈直徑為18～34 mm，菌株MAT1-2-1的褐變圈直徑為11～38 mm，而且單交配型菌株中褐變圈直徑≥32 mm的菌株有12株（占比17.14%），表明其抗鞣酸能力有明顯差異；不同菌株的菌核數量差異較大，產生塊狀聚合的菌核或分散狀態菌核或不產生菌核。結果表明，六妹羊肚菌不同原生質體再生菌株的生長勢、抗鞣酸能力之間有明顯差異和多態現象。這種單交配型原生質體再生菌株之間的多態現象與香菇[17]、阿魏菇[20]、平菇[21]、靈芝[22]、玉木耳[23]等的原生質體再生菌株的情況相類似。

在不同單交配型菌株多態性分析的基礎上，選取了20株MAT1-1-1單交配型原生質體再生菌株（褐變圈直徑25～34 mm、菌絲帶寬度2～10 mm、無菌核或產生菌核）和17株MAT1-2-1單交配型原生質體再生菌株（褐變圈直徑23～34 mm、菌絲帶寬度1～10 mm、無菌核或產生菌核）等表現較好的單交配型原生質體再生菌株（表1中加粗的菌株）進行雜交實驗。

2.2 雜交菌株的多態性分析結果

雜交菌株的多態性分析結果見表2。

表2 六妹羊肚菌原生質體單核化再生菌株的雜交結果Table 2 Hybridization results of Morchella sextelata protoplast monokaryotic regeneration strains

由表2可知，實驗通過對雜交菌株的菌落尖端菌絲的3次連續轉接和菌株交配型測定，從63株“雜交”菌株中得到了40株具有雙交配型的雜交菌株，剔除了23株假雜交菌株（單交配型，數據略）；雜交成功率達63.5%。賀國強[26]通過對梯棱羊肚菌不同交配型的子囊孢子進行對峙培養雜交，獲得1株雜交菌株；賀新生等[29]研究指出，羊肚菌同一單孢菌株的菌絲是自體融合的，子囊孢子的單孢菌株中存在交配型分離、假同宗結合“異核體”和大量營養體不親和的現象。本研究使用六妹羊肚菌同一母本（雙交配型）的原生質體單核化再生菌株進行多態性分析的過程中，雖然發現少數原生質體再生菌株之間存在不親和拮抗現象，但大多數再生菌株之間是親和的；而且通過對峙培養雜交和尖端菌絲的連續轉接，獲得了高比例的雜交菌株。后續擬采取更精準的方法如核熒光標記[34]等技術對這些雜交菌株作進一步鑒別。

由表2亦可知，雜交菌株在PDA（鞣酸）平板上的生長勢、抗鞣酸能力以及在CYM斜面上菌核數量方面存在明顯差異，雜交菌株的菌絲帶寬度均≥10 mm，褐變圈直徑為32～54mm，而單交配型親本菌株的菌絲帶寬度均≤10mm，因此雜交菌株在生長勢、抗逆能力等方面均顯著優于單交配型親本菌株，異核體雜交優勢明顯。原因可能是由于羊肚菌菌絲生長迅速，菌株生長速度可達8.0～19.5 mm/d[27]，但在常規培養條件下不易發現單交配型和雙交配型雜交菌株之間的差異性，而本實驗通過在培養基中添加鞣酸大幅度降低了六妹羊肚菌菌絲的生長勢（菌株生長速度均≤2.0 mm/d）、增加了菌絲致密度，加上菌絲塊間的營養競爭，使得單交配型菌株和雙交配型雜交菌株之間的差異性和雜交優勢表現得更充分、更明顯和易于觀察到。

雜交菌株的產菌核能力有明顯差異，雜交菌株、單交配型親本菌株都能產菌核或不產菌核，產菌核能力與菌株交配型沒有相關性，該結果與蔣林林等[31]在減數分裂后代中發現的情況和看法相一致；根據40株六妹羊肚菌雜交菌株在斜面培養基上的菌絲和菌核的豐度差異，可以將其分為菌核型、菌絲型和混合型三種生長類型。

2.3 雜交菌株的交配型測定結果

由以上結果可知，從63株“雜交”菌株中得到了40株具有雙交配型的雜交菌株及23個單交配型雜交菌株，部分雜交菌株的交配型電泳結果見圖1。由圖1可知，UV101×UV57雜交菌株只有一條擴增帶，因此進行剔除（數據略），其他雜交菌株有兩條擴增帶，為真雜交菌株，由此可知，六妹羊肚菌原生質體單核化再生菌株的雜交成功率較高。實驗發現，直接挑取PDA（鞣酸）平板上的菌絲體進行交配型檢測，無法得到交配型基因的擴增條帶；而將該菌絲體進一步轉接到不含鞣酸的CYM斜面上培養則又可以重新檢測到交配型基因的擴增條帶；可見羊肚菌交配型能否檢出或缺失問題不僅與羊肚菌組織結構[8]、菌核及繼代培養[30-31]、減數分裂及子囊孢子形成[32-33]等生命過程有關，還可能會受到菌絲生理狀態或生長抑制物存在與否、細胞核是否降解[34]等因素的影響。

圖1 部分雜交菌株的交配型電泳結果Fig.1 Mating type electrophoresis results of some hybrid strains

3 結論

本研究對六妹羊肚菌原生質體單核化再生菌株的多態性進行了分析，對其進行對峙培養雜交實驗制備雜交菌株。結果表明，不同原生質體單核化再生菌株的生長勢和抗鞣酸能力等存在差異和多態性；從63組對峙培養雜交實驗中獲得40株雜交菌株（占全部雜交菌株的63.5%），雜交菌株（雙交配型）比單交配型親本菌株具有更強的生長勢和抗鞣酸能力；根據六妹羊肚菌在斜面培養基上菌絲和菌核的差異，可以將雜交菌株分為菌核型、菌絲型和混合型三種生長類型。本實驗研究為六妹羊肚菌的原生質體單核化菌株多態性分離和雜交育種進行了有益探索。