基于核酸等溫擴增技術金黃色葡萄球菌檢測的研究進展

伊廷存，胡 梅，霍勝楠*，孟 靜，任意婕，翟清燕，孫瀟慧

（山東省食品藥品檢驗研究院 國家市場監管重點實驗室 肉及肉制品監管技術，山東 濟南 250101）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），普遍存在于空氣、食物、污水等環境中[1]。金黃色葡萄球菌及其腸毒素是造成細菌性食物中毒的最常見原因之一，在動物養殖、食品生產加工和食品監管方面均存在隱患。因此，快速準確地檢測金黃色葡萄球菌是確保食品安全和保護人類免受食源性疾病侵害的關鍵因素。基于傳統培養的檢測方法是食源性致病菌檢測的金標準，但費時又費力。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是基于核酸鍵比對的檢測技術，提高了靈敏度和特異性，但PCR需要熱循環擴增儀器和復雜的擴增程序，無法滿足現場快速檢測的需求。核酸等溫擴增技術是PCR的替代方案，等溫擴增是一種使用簡單的溫度控制器擴增核苷酸鏈的技術，允許核酸擴增在單一的恒定溫度下進行，無需熱循環儀，具有檢測效率高，檢測速度快，設備簡單等優勢，在現場快速檢測方面的適用性高，可有效應用于食源性致病菌的檢測[2-3]。

目前，檢測金黃色葡萄球菌的核酸等溫擴增檢測技術有環介導等溫擴增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）、重組酶介導擴增（recombinase aided amplification，RAA）、滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）等。此外，國家也發布了金黃色葡萄球菌等溫擴增檢測的標準，如SN/T 2754.1—2011《出口食品中致病菌環介導恒溫擴增（LAMP）檢測方法第1部分：金黃色葡萄球菌》[4]等。金黃色葡萄球菌現場快速檢測技術仍存在靈敏度低、檢測時間長等問題，無法滿足食品安全監督管理和食品產品質量控制的需要。

因此，為了適應食品安全監管的新形勢，提升食品安全監管的技術水平，本文闡述了常見的核酸等溫擴增技術中的環介導等溫擴增（LAMP）、滾環擴增（RCA）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、重組酶介導擴增（RAA）的原理及優缺點，主要闡述了核酸等溫擴增技術技術在金黃色葡萄球菌檢測上的應用，并總結了其目標產物檢測技術，以期為金黃色葡萄球菌等溫擴增快速檢測技術開發提供理論支持。

1 核酸等溫擴增技術的原理及優缺點

1.1 核酸等溫擴增技術的原理

LAMP是一種通過使用具有高置換鏈活性的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶和一組專門設計的引物擴增目標DNA鏈的分子生物學檢測方法。首先，將正向內引物（forward inner primer，FIP）雜交到靶DNA的F2c區域，并合成互補鏈，接下來，在外引物F3雜交到F3c區后開始鏈置換。然后釋放互補鏈并用作向后內引物。接下來，將后向內引物（backward inward primer，BIP）雜交，并開始鏈合成。隨后，使用B3引物完全合成互補的DNA鏈，并產生啞鈴形或莖環DNA用于LAMP循環擴增[5]。

RCA是一種等溫擴增反應，由在37 ℃下具有鏈置換活性的DNA聚合酶催化完成。獨特的寡核苷酸掛鎖探針（padlock probe，PLP）與靶序列雜交，在DNA連接酶作用下合成環狀模板。特異引物與環狀模板對齊后，在DNA聚合酶的作用沿環延伸，并且先前生成的延伸鏈不斷被替換。最終產生數百至數千個重復的長單鏈DNA產物，包括單引物擴增RCA（single-primer RCA）、多引物擴增RCA（multiple-primer RCA）和指數擴增RCA（exponential RCA）[6-7]。另外，在RCA基礎上開發了一種跨越式滾環擴增（saltatory rolling circle amplification，SRCA），實現了非閉環DNA模板擴增，且無需形成環狀結構[8]。

RPA是由加載因子（T4 UvsY）、重組酶（T4 UvsX）、聚合酶（Bsu）和單鏈結合蛋白（T4 gp32）以及兩條特異性的上下游引物參與的一種等溫擴增反應。首先，T4 UvsX重組酶在T4 UvsY蛋白的幫助下與寡核苷酸引物結合，形成重組酶-引物復合物，然后這些復合物與目標dsDNA的同源序列雜交，并在同源位點啟動鏈侵襲。解鏈的DNA鏈通過單鏈結合蛋白（T4 gp32）穩定，具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bsu）結合到引物的3'端，并且在脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）存在下進行引物延伸，并實現DNA產物的指數放大[9]，RPA已由TwistDx商業化[10]。

RAA與RPA具有相似的原理，區別是其重組酶UvsX來自于大腸桿菌（Escherichia coli），而RPA是噬菌體重組酶。RAA是由江蘇奇天公司研發，并進行了商業化生產[11]。

1.2 不同核酸等溫擴增技術的比較及優缺點

核酸等溫擴增的顯著優勢是能夠使用簡單的熱控制儀器擴增核酸，且操作簡單，不需要專業的人員即可操作[12]。不同核酸等溫擴增技術的比較見表1。

表1 不同核酸等溫擴增技術的比較Table 1 Comparison of different nucleic acid isothermal amplification technology

由表1可知，4種核酸等溫擴增技術的反應溫度范圍為37～65 ℃，越高的溫度對設備的要求就越高，RPA和RAA的反應溫度為37～40 ℃，更接近室溫環境。除此之外，LAMP和RCA擴增反應前還需要95 ℃的條件進行雙鏈DNA（double strand DNA，dsDNA）解鏈為單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA），且在擴增反應的最后還需80 ℃和60 ℃條件下擴增以提高檢測的靈敏度。而RPA和RAA可以直接作用于dsDNA，不需要額外的加熱步驟[7]。對于擴增類型而言，4種等溫擴增技術都可實現指數擴增。對于聚合酶而言，3種DNA聚合酶都具有鏈置換活性和5'→3'聚合酶活性，而phi29 DNA聚合酶可連續合成長片段的DNA，RAA采用的來源于細菌和真菌的DNA聚合酶相較于RPA具有更高的活性[13]。對于反應時間而言，RPA和RAA的反應時間最短，可實現靶基因的快速檢測，有利于開發食源性致病菌的快速檢測。對于目標基因長度，RCA能夠擴增的片段最長。對于引物數量而言，LAMP需要4～6個引物，引物設計復雜，容易引起非特異性擴增。

LAMP具有出色的特異性和擴增速率，但其主要缺點是靶DNA長度的限制和擴增子的復雜結構。LAMP的最佳靶標長度＜300 bps，因此設計引物時不建議擴增＞500 bps的靶DNA[14]。RPA的主要缺點是設計引物的難度很高，由于RPA在相對較低的溫度下工作，因此較長的引物形成的二級結構不會變性，但這可能導致擴增失敗，因此建議使用30～45個堿基對范圍內的引物[15]。RPA的第二個缺點是它對目標序列選擇的限制。盡管RPA能夠擴增高達1.5 kb的長序列，但它更適合80～400 bps的短序列，最好為100～200 bps[16]，另外RPA和RAA還支持多重擴增反應，適合開發多種食源性致病菌的同時檢測[17]。RCA由于使用PLP擴增線性靶標DNA會導致測定的特異性更高，且存在非特異性擴增和引物設計的復雜問題[3]。此外，RAA試劑的成本要較RPA的試劑成本低，也是開發金黃色葡萄球菌的快速檢測技術的一大優勢。

2 核酸等溫擴增技術技術在金黃色葡萄球菌檢測上的應用

采用核酸等溫擴增技術檢測金黃色葡萄球菌的流程如下：

2.1 金黃色葡萄球菌核酸等溫擴增檢測限

核酸等溫擴增技術在金黃色葡萄球菌檢測上得到廣泛應用，基于等溫擴增技術檢測金黃色葡萄球菌的相關研究進展見表2。

表2 核酸等溫擴增技術在金黃色葡萄球菌檢測上的應用Table 2 Application of nucleic acid isothermal amplification technology in Staphylococcus aureus detection

由表2可知，靈敏度越高，能從樣品檢測到金黃色葡萄球菌的可能性就越高；檢測限越低，越能真實反應樣品中污染的金黃色葡萄球菌。LAMP、RCA、RPA和RAA的檢測靈敏度均能達到100 CFU/mL（g），但SOWMYA N等[23]建立的金黃色葡萄球菌LAMP方法，只能檢測牛奶、甘蔗汁和米飯中低至100 CFU/mL（g）的金黃色葡萄球菌，SHEET O H等[24]開發的基于基因nuc的LAMP檢測方法，僅能檢測牛奶中低至9×102CFU/mL的金黃色葡萄球菌，HASSAN M等[25]開發了基于femA和arcC基因檢測金黃色葡萄球菌的LAMP方法，可檢測到食品中100 CFU/mL（g）的金黃色葡萄球菌。WANG Y T等[26]建立了免疫磁分離-RCA檢測金黃色葡萄球菌的方法，可檢測果汁中低至3.3×102CFU/mL的金黃色葡萄球菌。LI Y N等[27]描述了用于測定金黃色葡萄球菌DNA的比色微孔板法，金黃色葡萄球菌目標序列的檢測限為1.2 pmol/L的基因組，并驗證了該方法在食品樣品中的應用潛力。YANG Q等[20]建立了一種SRCA方法來檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，其熒光檢測方法的檢測限為56 CFU/mL，與傳統的PCR方法相比，SRCA測定的靈敏度至少提高了100倍，但該方法需要94 ℃預變性3 min，80 ℃孵育5 min，增加了檢測成本。

CHENG R等[28]采用一種基于免疫磁珠和RPA結合的免疫磁分離法檢測牛奶和豬肉中的金黃色葡萄球菌菌株，在人工污染樣品中的檢測靈敏度為5.1×101CFU/mL。HU J Q等[29]建立的基于RPA和聚合物絮凝沉降的新型檢測方法，人工污染食品樣品中金黃色葡萄球菌的檢測限為38 CFU/mL（g）。王雨[30]建立了一種基于RPA-側向流動試紙條（lateral flow dipstick，LFD）的快速、可視化檢測系統，可以對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌兩種重要的食源性致病菌實現高靈敏性、強特異性的快速有效檢測，在加入金黃色葡萄球菌的肉、海鮮、蔬菜、牛奶、雞蛋等食品基質中金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為20 CFU/mL（g）。后來旺等[31]開發的RAA-側流層析試紙方法，靈敏度分析結果表明金黃色葡萄球菌的檢出限為1.83×102CFU/mL。QIAN J J等[22]建立了檢測金黃色葡萄球菌的RAA-LFD技術，人工污染醬油、豆汁、果奶和牛奶樣品的檢測限為2×101CFU/mL。

同種等溫擴增技術基于不同的樣品基質，其檢測限也存在差異，如XIONG J等[32]開發的可視閉管LAMP方法，僅能檢測到干魚制品中3×103CFU/g的金黃色葡萄球菌，HU J Q等[29]建立的RPA方法可以檢測到牛奶、蝦、魚、剩米飯中低至3.8 CFU/mL（g）的金黃色葡萄球菌，而在豬肉、奶酪和雞蛋中的檢測靈敏為38 CFU/g。分析其原因，可能是由于不同樣品存在的抑制劑不同，也可能是樣品基質本身的成分對等溫擴增反應存在干擾，如奶酪和雞蛋的高黏稠度降低了DNA的提取效率，高脂肪高蛋白質干擾了等溫擴增反應的進程等。因此，應針對不同的樣品基質考慮等溫擴增反應種類并研究其檢測的靈敏度。

2.2 核酸等溫擴增技術檢測金黃色葡萄球菌的目標基因

金黃色葡萄球菌檢測常用基因見表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢測常用基因Table 3 Common genes for Staphylococcus aureus detection

由表3可知，檢測金黃色葡萄球菌常用的靶基因主要有nuc、femA、mecA、arcC、gyrB等。nuc基因是編碼金黃色葡萄球菌細胞外熱穩定核酸酶（thermostable nuclease，TNase）蛋白的物種特異性基因，在不同菌株之間具有較高的保守性，是檢測金黃色葡萄球菌應用最廣的目標基因[33-34]。femA為金黃色葡萄球菌特異性基因，是耐藥基因的輔助基因，其所編碼蛋白與細胞壁肽聚糖五甘氨酸橋合成有關，已被用作鑒定金黃色葡萄球菌的分子標記，在系統發育上也是保守的，葡萄球菌之間的差異低于20%[30]；mecA編碼青霉素結合蛋白2a基因，是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的特異性基因，常與nuc基因結合檢測金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；arcC為編碼氨基甲酸酯激酶的基因，是金黃色葡萄球菌七個管家基因之一，對金黃色葡萄球菌具有特異性；gyrB編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因。

金黃色葡萄球菌的目標基因越保守，其檢測準確度就越高，越能同其他細菌區分開。此外，選擇其他方法確定金黃色葡萄球菌靶基因也有相關研究報道，如WU C等[35]通過對國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫中金黃色葡萄球菌基因組序列和NCBI的非冗余核酸數據庫下載到本地服務器，通過本地基于局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）和在線比對篩選金黃色葡萄球菌的潛在特異性基因，并滿足種間特異性和種內普遍性的標準，建立了特異性的LAMP檢測方法，檢測限為4×102CFU/mL，對金黃色葡萄球菌的特異性為100%，與傳統的PCR相比，LAMP將檢測限降低了220倍。

3 目標產物檢測技術

3.1 比色法

比色法是借助反應體系中的特殊成分（如MnCl2），加入特定的比色顯色試劑（金屬敏感染料和pH敏感染料）生成定性的顏色結果[36]。顯色試劑一般有甲酚紅（由紅色到黃色）、羥基萘酚藍（深藍色到藍色）和骨鈣黃素（深黃色到黃色），以及孔雀石綠（深藍色到淺藍色）和無色結晶紫等[37]。CHEN X等[38]采用孔雀石綠作為比色劑，陽性結果會由無色變為綠色，開發了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的LAMP比色檢測方法，檢測限為100 fg的基因組DNA。此外，還可以通過觀察沉淀物來辨別檢測結果，HU J Q等[29]提出了一種基于RPA和聚合物絮凝沉降的新型檢測方法，0.2 g/mL PEG8 000與0.5 moL NaCl溶液混勻后，與RPA產物1∶1混勻，加入10 μL免疫磁珠結合目標產物進行磁分離洗滌，乙酸鈉緩沖液作用下產生絮凝沉降，目視可檢測低至1.3×10-5ng的金黃色葡萄球菌基因。XIONG J等[32]以5種pH敏感指示劑進行目視評估，比較溴百里酚藍、酚紅、甲酚紅、中性紅和羥基萘酚藍的靈敏度和特異性，最終選擇甲酚紅建立了基于pH敏感指示劑的閉管LAMP檢測方法，可檢測5.4 copy/μL金黃色葡萄球菌基因產物。

采用比色法檢測，無需任何復雜的檢測儀器或訓練有素的人員即可完成，特別適用于資源有限環境下金黃色葡萄球菌的現場檢測。但比色法也存在一些缺點，在復雜的生物樣品中很難看到產生的顏色，需要一雙“有經驗的眼睛”來解釋顏色變化[39]；另外還存在靶基因特異性弱，假陽性結果等問題。因此，為提高檢測結果的準確性，會將比色法與紙芯片、智能化平臺[40]結合，以實現檢測結果的定量分析。

3.2 熒光測定

熒光測定是實時監測擴增的直接方案，通過加入與DNA相結合的熒光染料指示擴增反應，常用的熒光染料有溴化乙 錠、PicoGreen、SYBR Green I、GelRed 和GelGreen 等。SYBR Green I與dsDNA結合時，用紫外線照射時會發出綠色熒光[24，28]。王芳等[41]將擴增產物DNA與[Ru（bpy）2（dppz）]2+結合后產生的強烈紅色熒光信號判定結果，SU J Y等[42]以SYBR Green指示染料建立了金黃色葡萄球菌的orfXLAMP檢測方法，具有很高的特異性和靈敏度。KHOSRAVI A D等[43]采用SYBR Green I評估金黃色葡萄球菌的LAMP擴增產物，在紫外線下將橙色變為綠色，與PCR結果100%一致。FAN X R等[21]通過SYBR Green I結合重組酶聚合酶擴增，建立了金黃色葡萄球菌的快速、視覺和無設備的即時檢測方法。熒光測定可以實現肉眼觀察，也可以使用成本低的便攜式熒光閱讀器進行檢測，從而實現檢測的定性和定量分析，司曉雪[44]建立了一種基于3,3'，5,5'-四甲基聯苯胺-辣根過氧化物酶-過氧化氫顯色體系的金黃色葡萄球菌快速可視化檢測方法，具有良好的特異性和穩定性。然而，熒光染料存在擴增抑制問題，如SYBR Green I可顯著抑制擴增反應。為了降低其抑制效應，可采用閉管方式[23]或者蠟封管方式[10]，也可選擇旋轉管方式[45]。

3.3 側向流技術

側向流測定（lateral flow assay，LFA）技術是通過肉眼觀察測試線的顏色變化來進行檢測的一種分析技術，基于金納米顆粒（Au Nanoparticles，AuNPs）積累引起的顏色變化進行判斷，用于現場檢測和量化目標物質，將待測樣品添加到獨立設備上，幾分鐘內即可獲得結果[46-47]。側向流技術與不同的載體結合（如試紙條、傳感設備）可建立不同側向流測定技術。側向流測定技術結構示意圖見圖1。由圖1可知，LFA的典型結構包括多孔膜、樣品墊、接合墊和吸收墊，分為樣品區、檢測區和控制區。LFA具有研發生產成本低、易于使用的特點，是快速檢測最佳選擇之一。將等溫擴增方法與LFA相結合，可以確保在非實驗室條件下具有超高的測試靈敏度，并降低了對設備的要求[48]。LFA通過與LAMP、RPA、RAA結合使用檢測金黃色葡萄球菌，展示了檢測系統的高靈敏度、便捷性。WANG Y L等[49]將RPA與LFA技術結果開發了檢測金黃色葡萄球菌的IMS-RPA-LF方法，能夠檢測牛奶樣品中低至40 CFU/mL的金黃色葡萄球菌。后來旺等[31]建立了RAA-LFA檢測金黃色葡萄球菌的方法，具有特異性強、靈敏度高等特點。但LFA仍然存在一定的不足，如可能存在樣品污染，對環境控制力弱、檢測結果的準確度等問題。

圖1 側向流試紙條結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of lateral flow test strip structure

另外，隨著新型納米材料的開發和研發技術的提高，設計了基于納米顆粒的側向流生物傳感器（lateral flow biosensor，LFB），原理與LFA相似，LFB采用的塑料盒固定封裝，由吸收墊、硝酸纖維素膜、樣品墊和共軛墊有序地組裝在背卡或設備上[34]。CHEN X等[38]建立了基于納米顆粒的側向流生物傳感器（LAMP-LFB），用于檢測所有金黃色葡萄球菌，特異性為100%。LFB提供了更多的可視化，不需要特殊的儀器、控制器和過程，成為分析產物的優選方法[34]。

4 結論

核酸等溫擴增技術作為近十多年來興起的新技術，具有設備簡單、反應速度快、靈敏度高等優點，已經成為食源性致病菌檢測的研究熱點。金黃色葡萄球菌作為全球大多數國家的食品安全法定檢測項目，開發了大量的金黃色葡萄球菌等溫擴增技術，在保障食品安全和控制食源性疾病方面均發揮了巨大作用。

本文通過介紹LAMP、RPA/RAA、RCA技術的反應機制，比較了幾種等溫擴增技術的優勢和劣勢，為后續等溫擴增技術的選擇提供了參考。同時，從金黃色葡萄球菌等溫擴增檢測方法的檢測限、目標基因和目標產物檢測技術方面闡述了金黃色葡萄球菌等溫擴增技術的研究進展。其中，RPA、RAA反應具有需求溫度低，檢測時間短，可同時檢測多種病原體等優勢，適合開發快速檢測技術。比色法、熒光測定法和側向流技術都屬于視覺檢測技術，通過肉眼觀察即可判斷結果，在設備便捷、檢測時間等方面具有一定的優勢。本文為開發金黃色葡萄球菌等溫擴增檢測方法提供理論支持，為研發金黃色葡萄球菌的即時檢測設備奠定基礎。