己酸菌的篩選及其在濃香型白酒生產中應用的研究進展

殷想想，王欣蕊，馮文聰，李 良，陳 暉，董孝元，常 煦，方尚玲，陳茂彬*

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 工業微生物湖北省重點實驗室 發酵工程教育部重點實驗室 工業發酵省部共建協同創新中心，湖北 武漢 430068；2.黃鶴樓酒業有限公司，湖北 武漢 430050；3.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

白酒是中國特有的蒸餾酒，與白蘭地、伏特加、威士忌、朗姆酒、金酒并稱為世界六大蒸餾酒[1-2]。白酒按照香型分為濃、清、米、醬四種基本香型[3]。其中，濃香型白酒以其“窖香優雅、綿甜爽凈、酒體柔和協調”的特點深受消費者喜愛[4]。濃香型白酒是以富含淀粉的谷物為原料如高粱、小麥、糯米、玉米和大米的混合物，以大曲為糖化發酵劑，在棲息于窖池中大量微生物的參與下，自然固態發酵生產[5]。

濃香型白酒發酵過程是在封閉的窖池中進行的，窖池是濃香型白酒形成獨特風味的基礎。據了解，濃香型白酒的主體香味物質-己酸乙酯，就是由窖池中己酸菌所產己酸和乙醇酯化形成的[6-7]。因此，己酸菌被普遍認為是濃香型白酒釀造過程中最重要的一類功能微生物之一[8]。優良己酸菌有助于窖泥質量和基酒品質的提升。本文對己酸菌的篩選、己酸菌的產酸途徑、己酸菌與其他釀酒微生物之間的互作以及己酸菌在濃香型白酒生產中的應用等方面進行綜述，以期能夠以更加科學的方式將己酸菌應用于生產，提高濃香型白酒的品質。

1 己酸菌的研究情況

1.1 己酸菌篩選

己酸菌是一類能夠以乙醇、乳酸、葡萄糖等為碳源，代謝合成己酸的一類微生物的統稱。目前，已經從窖泥、牛胃、酒糟等篩選出的產己酸菌株主要包括梭菌屬（Clostridium）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、巨球型菌屬（Megasphaera）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等[9-12]，具體信息見表1。

表1 己酸菌的篩選Table 1 Screening of hexanoic acid bacteria

1.2 己酸菌的產酸途徑

研究表明，己酸菌主要以乙醇、乳酸、葡萄糖為電子供體通過逆β氧化途徑產生己酸[22-25]。己酸合成途徑如圖1所示。以乙醇為碳源合成己酸一般分為三步：乙醇的氧化、丁酸的形成、己酸的形成。在步驟1中6分子乙醇有1分子氧化為乙酸提供腺苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP），另外5分子氧化為乙酰輔酶A通過逆β氧化途徑參與碳鏈的延伸，乙醇氧化也為逆β氧化途徑提供二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide adenine dinucleotide，NADH）。在步驟2中乙酰輔酶A經過一系列反應生成丁酰輔酶A，然后丁酰輔酶A和乙酸在酰基輔酶A轉移酶的作用下生成丁酸。在步驟3中乙酰輔酶A和丁酸結合，碳鏈進一步延長合成己酸[26]。以乳酸和葡萄糖為碳源合成己酸時，代謝途徑可能和以乙醇為底物時類似[27]。

圖1 己酸的合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of hexanoic acid

2 己酸菌與其他微生物間的相互作用

在濃香型白酒生態系統中，微生物種類繁多，己酸菌在濃香型白酒生產中避免不了被其他微生物的生長代謝所影響，因此除了需要研究溫度、pH、維生素C（vitamin C，VC）、碳酸鈣、乙醇等各種因素對己酸菌生長代謝的影響外[28-29]，還需要探究己酸菌與其他釀酒微生物之間的生長代謝關系，這對己酸菌在濃香型白酒生產中的應用是非常有必要的。

2.1 己酸菌與其他微生物互作的分析方法

在濃香型白酒發酵過程中，參與發酵的微生物種類繁多，己酸菌與其他釀酒微生物之間逐漸形成了競爭或者互利共生關系，微生物之間的相互作用逐漸形成了一個相對穩定的釀酒微生物群落，對提高白酒的品質起著關鍵的作用。目前，關于濃香型白酒中釀酒微生物的相互作用的研究主要通過氣質、氣相、高效液相色譜檢測發酵液中物質的變化差異，來推測其之間的互作機理，如通過氣相色譜測定單菌和混菌發酵液中己酸含量變化，推測它們之間相互促進或抑制。也可以通過高通量測序，分析它們之間的相關性，來確定它們之間是相互促進還是相互抑制。如通過共現網絡分析發現梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、甲烷桿菌綱（Methanobacteria）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia）之間存在大量顯著的正相關或負相關。

2.2 己酸菌與其他釀酒微生物的共培養

2.2.1 己酸菌與酵母菌共培養

研究發現，釀酒酵母與己酸菌共培養可有效促進己酸生產。晉湘宜等[30]篩選了一株葡萄糖抑制性的己酸菌，將己酸菌與酵母菌混合培養時，有助于己酸菌的提前形成，這是因為釀酒酵母和己酸菌混菌培養時，釀酒酵母可以優先利用氧氣為己酸菌提供一個厭氧環境，與此同時，酵母菌還可以優先利用葡萄糖，緩解葡萄糖對己酸菌的抑制作用。嵇翔等[31]同樣將克氏梭菌8022與釀酒酵母進行了混合培養，不僅縮短了發酵周期而且己酸產量從6.35 g/L提高至7.09 g/L，分析是由于釀酒酵母的存在為己酸菌的生長提供了厭氧環境，提高了己酸菌從乙酸到己酸的轉化速率。通過釀酒酵母與己酸菌的共培養初步探究出酵母菌促進己酸菌生長代謝可能是由于釀酒酵母對氧氣的消耗以及生長代謝所產生的乙醇可以為己酸菌生長代謝提供適量碳源造成的。

2.2.2 己酸菌與乳酸菌共培養

魏翠翠等[32]研究發現，瘤胃菌（CPB6）能高效利用乳酸生產己酸，但其利用葡萄糖生產己酸能力較差，增加了發酵成本。采用CPB6與植物乳桿菌（RJ25）共培養，兩種菌共培養時利用葡萄糖生產己酸17.794 g/L，是CPB6單菌種利用葡萄糖生產己酸（7.726 g/L）的2.3倍，己酸生產效率由21.77%提升至48.37%。這是因為當以乳酸為碳源的產己菌與乳酸菌共培養時，乳桿菌（RJ25）可以以葡萄糖為碳源生成乳酸為瘤胃菌（CPB6）產己酸提供碳源。ZHU X Y等[17]從中國濃香型白酒生態系統中富集到了一種獨特的微生物組，該微生物組以乳酸為碳源生產己酸。該發酵微生物組可以利用乳酸生成高達23.41 g/L己酸，比目前任何單一純化己酸菌株產量都要高，這一結果再一次證明了多菌種混合發酵對己酸菌的產量是有益的。

2.2.3 己酸菌與互營球菌共培養

孫紅等[33]為了研究濃香型白酒生態系統中主要功能菌的相互作用，將互營球菌（N.902）與梭菌（C.901）共培養，結果表明，互營球菌（N.902）對梭菌（C.901）的生長和代謝具有顯著促進作用，共培養過程中除了葡萄糖的消耗量增加，生物量增加外，C.90l的丁酸和己酸積累量分別增加0.44和0.63倍左右。據研究發現互營球菌（N.902）的產物為乙酸和乙醇，乙酸和乙醇都可以作為梭菌（C.901）逆β逆氧化途徑的底物，這可能是互營球菌（N.902）促進梭菌（C.901）提高己酸的主要原因。

2.2.4 不同來源己酸菌的共培養

來源不同的濃香型白酒窖泥中己酸菌的種類和特點各不相同，人們對它們之間的相互關系了解不多，因此對不同來源的己酸菌進行互作探究對己酸菌產酸的提升是有意義的。趙德義等[34]將不同來源己酸菌分別進行單獨和混菌培養，第10天測定己酸含量發現，己酸菌單獨發酵最高產量2 930.4 mg/L，比它們混合培養時己酸的產量3 365.6 mg/L要低。這表明將不同來源的己酸菌菌液混合培養可以促進不同窖泥微生物之間相互作用從而促進己酸菌的生長和代謝。

2.2.5 己酸菌與放線菌的共培養

郭威等[35-36]通過篩選，從窖泥中篩選獲得一株優良放線菌GW01，與己酸菌混合培養發酵比己酸菌純種發酵產酸量提高約31%。經研究發現，放線菌能夠提高己酸菌產酸量與放線菌所產黑色素有關，黑色素對己酸菌代謝的促進機理，這一結果可能和馬榮山[37]研究發現，在白酒發酵過程中添加適量維生素C（vitamin C，VC）可以提高己酸產量的機理是相同的。欒興社等[38]同樣也發現了一種鏈霉菌與己酸菌共培養時，對己酸菌產己酸具有促進作用，且該菌具有較強的利用硫和硫化物的能力，提高了酒品質并為窖泥脫臭提供了新的生物技術。這表明，不同類型的放線菌所產生的一些物質可能對己酸菌產量的提高有不同的影響。因此，研究己酸菌與放線菌之間的相互關系，對提高濃香型白酒品質具有一定的意義。

2.2.6 己酸菌與丁酸菌的共培養

丁酸菌和己酸菌是提供濃香型白酒主要風味物質的兩種功能微生物，對濃香型白酒品質起著關鍵的作用，因此，探究丁酸菌與己酸菌的相互作用及機理是非常有必要的。萬朕等[39]研究發現，將己酸菌與丁酸菌以1∶1的配比共培養時，己酸菌的己酸產量提高50%左右。丁酸是己酸菌合成己酸的前體物質，己酸菌發酵時添加適當的丁酸菌，可以為己酸菌提供一定量的丁酸作為合成己酸的前體物質，從而使己酸菌的代謝產量提高。

3 己酸菌在濃香型白酒生產中的應用

3.1 在窖泥中的應用

窖泥質量關系著濃香型白酒的質量，窖泥中的微生物是產生白酒中風味酯的關鍵前體物質。天然窖泥的成熟時間超過20年，而且窖池在生產發酵過程中會導致窖池中的營養物質逐漸減少，微生物代謝所產生的有害物質逐漸增加，使窖池中的有益微生物數量減少，從而導致釀造出來的濃香型白酒風味不夠、口感欠佳。隨著人們對窖泥中微生物群落變化的研究，分析并篩選出了窖泥中優勢菌屬-己酸菌，促使人們將己酸菌應用于人工窖泥的構建、窖池的養護等方面[40-42]。

3.1.1 在人工窖泥中的應用

人工窖泥的構建大部分是將分離出的己酸菌菌液加入窖泥、黃土、老窖泥、曲粉等中，并按照一定配比混合[43]。魯少文等[44]將以乳酸為碳源的瘤胃科梭菌（CPC-11）制作人工窖泥，并投入生產發酵35 d，在21 d時己酸含量達到最高，比初始含量提高了1.2倍，在35 d時己酸乙酯含量比初始含量提高了2.74倍。馬玉磊等[45]通過向人工窖泥中添加己酸菌液，使人工窖泥中己酸乙酯的含量最終為0.5 mg/g干土，有效的提高了窖泥的品質。路振華[43]將己酸菌培養液和酯化紅曲加入人工窖泥中，用以提高濃香型白酒品質。綜上所述，在人工窖泥制作中加入己酸菌，可以使己酸菌快速形成優勢菌群，加速人工窖池老熟，從而提高濃香型白酒中己酸乙酯含量。人工窖泥構建工藝流程如下：

3.1.2 在養窖護窖中的應用

張家慶[46]將實驗室制備的己酸菌液、酯化液黃水等按照一定比例配制窖池養護液，密封培養5 d后應用于退化窖池，酒質分析結果表明，養護后的退化窖池所產酒質的己酸乙酯、總酸、總酯相對養護前提升比例分別為42.7%、16.2%、37.5%。王鑫[47]通過前期恢復生產的窖池及新啟用的窖池兩方面分析，用己酸菌液潑灑窖池，對窖池窖泥進行養護，且得到較好成效。在保證出酒率正常，優級酒率提高的同時，該廠全年特級酒產率平均達10%以上（己酸乙酯350 mg/mL），研究獲得圓滿成功。楊月輪[48]將菌株SLXJNR3-1制備成菌液后，在窖池中應用，可以有效地提高窖泥中產己酸菌的數量水平，促進釀造過程中己酸、丁酸等的生成。徐敬征等[49]確定了最佳比例為己酸菌液30%，丙酸菌液30%，丁酸菌液20%，優質窖泥培菌液20%。實踐證明，通過向退化窖池中加入功能己酸菌液對窖泥進行微生態的養護效果是可行的。

3.2 己酸菌在新型白酒中的應用

“千年老窖萬年糟，好酒全憑窖池老”，這句話充分體現了窖池在濃香型白酒中的重要性。老窖雖好，但是也存在著一定缺陷，就是窖池的成熟期太長，這嚴重影響力濃香型白酒的發展。現如今，隨著科技的發展，人們發現己酸菌是窖池中主要的微生物，是生成己酸乙酯的主體微生物。

研究發現己酸乙酯是濃香型白酒中的主體香味物質，以己酸菌發酵液和乙醇為底物，在酯化酶的作用下生成己酸乙酯發酵液[50]，將其運用到無窖泥濃香型曲酒生產中，對提高白酒品質，降低生產成本，提高生產效率，具有一定的生產和實際應用價值。任靜[51]通過一系列的實驗確立了己酸菌酯化條件，得到效果與優質濃香型白酒的四大酯比例相仿的酯化液。四大酯比例為已酸乙酯∶乳酸乙酯∶乙酸乙酯∶丁酸乙酯=1∶0.78∶0.63∶0.08，將酯化液應用于新型白酒的生產，代替勾兌白酒的香精香料成分，改善和提高曲酒的品質，降低生產成本，有較強的生產實際應用價值。

4 結論與展望

己酸菌是濃香型白酒中最重要的功能微生物之一，對提高濃香型白酒的品質起著至關重要的作用。目前將篩選到的己酸菌主要用于人工窖泥的生產、窖池的養護、己酸菌發酵液的酯化等方面提高濃香型白酒品質。但是也存在己酸乙酯提高不足，白酒品質改善不明顯的問題，主要原因可能在于所篩選己酸菌產酸性不高、對氧氣的耐受性不好、易被其他微生物生長代謝所影響等。

在濃香型白酒生產過程中微生物種類繁多，己酸菌不可避免會被其他微生物的生長代謝所影響，研究己酸菌與其他釀酒微生物之間的生長代謝關系，是提高己酸產量的關鍵。

綜上所述，為了提升濃香型白酒品質、提高生產效率、降低生產成本，可采取以下措施：①利用微生物之間的相互作用，篩選厭氧性較好的高產己酸菌。②將篩選到產己酸較高的厭氧菌株與窖泥中其他對濃香型白酒的功能微生物共培養，探究出它們之間相互促進或抑制的機理，用于提高己酸產量。③將與己酸菌互作促進產己酸的復合己酸菌液應用到濃香型白酒人工窖池的構建、窖池的養窖護窖中以期在短時間內改善窖泥質量，以期在短時間內提高濃香型白酒品質，降低生產成本。④將高產己酸菌復合菌液或復合己酸菌發酵液酯化后應用到新型無窖泥生產濃香型白酒中，用以提升己酸乙酯含量和白酒品質，降低生產成本，提高白酒產量。