乳酸菌胞外多糖的合成、生物活性及應用研究進展

譚鳳翔，余元善，溫 靖，鄒 波，吳繼軍，徐玉娟，肖更生*，胡騰根，4

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌 330045；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510631；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室河源分中心，廣東 河源 517000）

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是由微生物在生長過程中產(chǎn)生并分泌到細胞外的多糖類物質[1]。目前，EPS已經(jīng)在食品與醫(yī)藥行業(yè)廣泛開發(fā)利用，如在食品行業(yè)中用于面包、乳制品等產(chǎn)品的生產(chǎn)加工[2]；在醫(yī)藥方面應用于用于生物支架，藥物開發(fā)等方向[3-4]。在已報道的EPS中，細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）作為種植牙材料、傷口敷料和臨時皮膚替代品，被大量研究，直接導致了其生物醫(yī)學產(chǎn)品的商業(yè)化[2]。另一種EPS—黃原膠市場價值不斷增長，預計2018～2027年全球黃原膠市場價值將增長1.5倍[5]。能產(chǎn)生EPS的微生物很多，其中乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）與人們的生產(chǎn)生活有緊密的聯(lián)系，因此由乳酸菌代謝生產(chǎn)的EPS備受關注。

乳酸菌EPS是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的粘液多糖或莢膜多糖，其具有高黏度和優(yōu)良的流變學特性，可作為天然安全的增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑用于改善食品的質地及口感，在一定程度上降低了傳統(tǒng)增稠劑和穩(wěn)定劑的使用，因而在食品和醫(yī)藥等工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應用前景[6]。此外，作為公認安全的食品微生物，乳酸菌代謝產(chǎn)生的EPS對人體無毒副作用、來源安全可靠，且對人體健康有著重要的促進作用，如增強人體免疫力、抗腫瘤、抗炎和降血糖等[7]。能產(chǎn)生EPS的乳酸菌種類很多，這使得乳酸菌EPS的種類也很多、來源較廣。同時，乳酸菌EPS的結構與活性也極具多樣性。

因此，研究乳酸菌EPS的產(chǎn)生及其結構性質具有很強的應用潛力。但乳酸菌合成EPS受多種條件的影響，如培養(yǎng)條件、物理環(huán)境、菌株種類等，不同的乳酸菌在不同條件下產(chǎn)生的EPS的結構、產(chǎn)量、性質各不相同。因此，為了綜合全面地了解乳酸菌EPS，本文從其產(chǎn)生菌、類型、代謝途徑、活性、合成影響因素和應用等方面進行了歸納，旨在為EPS的研究應用提供較為全面的信息。

1 乳酸菌與EPS

1.1 產(chǎn)EPS的乳酸菌

目前，已有研究報道能產(chǎn)生的EPS的細菌有醋桿菌屬（Acetobacter）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、布倫納菌屬（Brenneria）、地桿菌屬（Geobacillus）、葡萄醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、根瘤菌屬（Rhizobium）、酵母菌屬（Saccharomyces）、肌球菌屬（Sarcina）、鏈球菌屬（Strep tococcus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）和發(fā)酵單胞菌屬（Zymomonas）[8]。其中，乳酸菌是目前產(chǎn)EPS應用最為常見的細菌[9]。產(chǎn)EPS的乳酸菌主要有乳酸菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）[9]。產(chǎn)EPS的乳酸菌來源廣泛，如食品、嬰兒糞便、家禽腸道、水果、人體等。目前已研究報道的產(chǎn)EPS的乳酸菌及其來源見表1。

表1 產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌及其來源Table 1 Extracellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria and their sources

1.2 乳酸菌EPS的類型

根據(jù)EPS的單糖組成和糖鏈結構，可將其分為同型多糖（homopolysaccharides，HoPS）與雜型多糖（heteropolysaccharides，HePS）。胞外多糖也可以按照其與細菌位置關系分為粘液多糖與莢膜多糖，粘液多糖被釋放到細胞外，莢膜多糖則依附于細胞壁[24]。HoPS是EPS中結構最簡單的一類多糖，是由一種單糖重復單位連接形成線性或分枝結構[25]。HoPS 的特點是分子質量大（一般超過106Da）、產(chǎn)量高（高達10 g/L）[26]。能產(chǎn)生HoPS的菌有乳酸菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、酒球菌屬（Oenococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）。HePS是結構復雜的多糖，由不同的單糖重復單位組成，其可能在C2、C3、C4或C6位置分支，也可能沒有分支[27]。規(guī)則的重復單位包括3～8個單糖（D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和其他糖類）、單糖的衍生物（N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺和葡萄糖醛酸）和非碳水化合物取代基[28]。單糖可以以吡喃糖或呋喃糖形式的α或β異構體形式出現(xiàn)，與HoPS不同，碳水化合物部分是由細胞內糖核苷酸前體合成的[29]。一般來說，HePS的分子質量為104～106Da[30]，通常它們的產(chǎn)量為25～600 mg/L[31]。HePS是由乳酸菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）產(chǎn)生的。如不同乳酸菌屬（Lactobacillus）產(chǎn)生的HePS的單糖組成存在較大差異，大多由3～6種不同的單糖組成[32]。

目前已有研究報道的乳酸菌EPS很多，如HoPS有右旋糖苷葡、纖維素、果聚糖、菊粉和變形聚糖等；HePS有黃原膠、開菲爾多糖等。常見的HoPS來源與應用見表2。

表2 常見同型多糖生產(chǎn)菌來源及其應用Table 2 Source and application of common homopolysaccharides produced by bacteria

1.3 乳酸菌EPS的提取與分離

多糖的提取手段有水提法、酶解提取法、酸堿提取法、超臨界提取法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等[34]。但這些提取方法都是針對固體物料。乳酸菌EPS一般存在于溶液體系中，因此通過醇沉的方法就能起到很好的分離效果。乳酸菌發(fā)酵完多糖后用離心的方法去除細胞，然后除去蛋白。傳統(tǒng)的脫蛋白質方法有Sevage法、三氯乙酸沉淀法、蛋白酶水解法、鞣酸法和鹽酸法等[35]。其中Sevage法較為溫和，效果好，應用較為廣泛。除去蛋白后再用醇沉法得到粗多糖沉淀。粗多糖在經(jīng)過色譜柱（二乙氨基乙基纖維素或葡聚糖Sephadex色譜柱）分離得到高純度的EPS[36]。

2 乳酸菌EPS的合成途徑

EPS合成有4個途徑：Wzx/Wzy依賴途徑、ABC轉運蛋白依賴途徑、合成酶依賴途徑和蔗糖酶蛋白胞外合成途徑[37]。胞外多糖合成途徑見圖1[38]。

圖1 乳酸菌胞外多糖的合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of extracellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria

Wzx/Wzy依賴途徑：Wzx/Wzy依賴通路包括三個階段：（a）核苷酸糖的合成；（b）重復單元的組裝；（c）聚合和輸出[39]。首先，糖殘基被主動運輸?shù)郊毎麅炔⑥D化為各種單體單元，這些單體單元被轉移至細胞膜上的脂質載體（C55脂質載體）上并與之連接形成十一異戊烯磷酸（undecaprenyl pyrophosphate，Und-P）[40]。其次，通過GT將更多的糖單元鏈接至Und-P上產(chǎn)生重復單元，這些重復單元通過Wzx翻轉酶在細胞質膜上轉移[41]。最后，重復單元通過各種酶修飾后，如甲基化和乙酰化，被Wzy蛋白連接聚合成多糖[42]。組裝的多糖通過ABC轉運蛋白釋放到細胞表面[43]。通過Wzx/Wzy依賴途徑合成的多糖主要為HePS[44]，如結冷膠和黃原膠[30]。

ABC轉運蛋白依賴途徑：在ABC轉運蛋白依賴的途徑中，游離的糖單元被運輸?shù)郊毎ど系腢nd-P上，形成Und-PP-糖分子[45]。位于細胞質側內膜的特異性GT催化Und-PP-糖分子合成完整的多糖，然后通過位于內膜的外排泵復合物將其轉運穿過內膜至細胞表面[46]。ABC轉運蛋白依賴途徑主要參與莢膜多糖的合成，如黃色粘球菌（Myxococcus xanthus）合成的EPS[45]。

合成酶依賴途徑：主要合成的是由同種類型的糖單元組成的HoPS，如海藻酸鹽和細菌纖維素[47]。通過合成酶依賴途徑，UDP-Glc單元通過膜上的酶（內膜轉運體）組裝合成BC[48]。

蔗糖酶合成途徑：通過蔗糖酶合成途徑合成的EPS主要有右旋糖酐和左旋糖酐，其是在細胞外蔗糖酶的作用下，由蔗糖分子裂解獲得的前體在細胞外組裝產(chǎn)生而成的。蔗糖通過細胞外蔗糖酶轉化為細胞膜外的單體單元[47]。根據(jù)單糖單元被轉移到引物分子的不同，產(chǎn)生果聚糖或葡聚糖。有趣的是，反應條件和蔗糖酶會導致聚糖分子質量改變或分支改變[47]。通過使用不同的引物分子，如麥芽糖、異麥芽糖或黑莓糖等，可以生產(chǎn)更多的低聚糖變體，顯示出特定的生物活性的低聚糖，這在生產(chǎn)具有巨大的應用潛力[49]。

3 乳酸菌EPS的活性

乳酸菌EPS具有很多生物活性，如抗氧化、免疫活性、抗腫瘤和抗炎等。這些特性使乳酸菌EPS擁有非常廣泛的應用途徑與巨大的應用潛力，是材料與藥物開發(fā)的新型材料。

3.1 抗氧化活性

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）對機體有害，它們很容易與細胞中的其他生物大分子（脂類、蛋白質、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA））發(fā)生反應，導致多種疾病產(chǎn)生[50]。從乳酸菌中提取的EPS是天然的抗氧化劑且與合成抗氧化劑相比無毒性作用，是合成抗氧化劑的理想的替代品[51]。格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）FR4產(chǎn)生的EPS（4 mg/mL）對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（75.95%）有顯著的清除活性[13]。從印度蒸米糕中分離的乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）KC117496產(chǎn)生的葡聚糖（500 μg/mL）對DPPH自由基（74%）和羥基自由基（97.8%）有顯著的清除活性[52]。

3.2 免疫調節(jié)活性

據(jù)報道，EPS可以作為免疫調節(jié)劑調節(jié)機體免疫活性[53]。且EPS可以預防免疫缺陷引起的疾病，如炎癥性腸病等。XIU L等[54]報道了干酪乳桿菌WXD030產(chǎn)生的EPS能使CD4+T細胞中IFN-γ和IL-4的表達上調，使細胞免疫活性增強。EPS可通過調節(jié)細胞因子等信息分子來改變機體免疫功能[55]。如HIDALGO-CANTABRANA C等[53]報道了中性和大分子（分子質量接近106Da）的EPS能幫助細菌避開宿主的免疫系統(tǒng)，而小分子的EPS能夠溫和的刺激免疫細胞增強免疫。另外，EPS的支鏈構象和復雜性對免疫調節(jié)活性影響也很大，如，ISMAIL B等[56]研究發(fā)現(xiàn)α和β-1,3-鍵連接的葡萄糖和甘露糖可以激活免疫系統(tǒng)，如促進淋巴細胞增殖。

3.3 抗癌活性

細胞異常發(fā)育會導致癌癥的產(chǎn)生，對身體各個器官造成損傷。目前治療癌癥的化療和放療會給機體帶來極大的副作用。開發(fā)天然安全、對免疫系統(tǒng)副作用低的抗腫瘤藥物是當前研究的熱點[17]。乳酸菌EPS獨特的分子特性（單糖組成和分子質量等）使其具有良好的抗癌活性，且副作用小[57]。有研究報道，乳糖桿菌產(chǎn)生的EPS G10在400 μg/mL質量濃度下激活和上調了HeLa細胞中Caspase 3蛋白和BAX基因的表達，抑制HeLa細胞的增殖[18]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NCU116產(chǎn)生的EPS通過調節(jié)小鼠toll樣受體-2（TLR-2）的活性，增加Fas、FasL和c-Jun等促凋亡基因的表達抑制癌細胞的增殖[58]。

3.4 抗炎活性

炎癥反應是機體應對各種損傷因子刺激，如細菌、病毒感染等，做出的以防御為主的病理反應。有研究報道乳酸菌EPS具有很好的抗炎活性，如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）產(chǎn)生的HePS可以激活巨噬細胞的活性，促進巨噬細胞增殖和促炎因子的釋放，且與EPS的濃度呈劑量依賴[18]。戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）LZ-R-17產(chǎn)生的EPS可促進巨噬細胞分泌炎癥因子NO、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白介素（interleukin，II-1β）、IL-6和IL-10[59]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）KL37的EPS能刺激小鼠腹腔巨噬細胞分泌促炎因子（TNF-α、IL-6、IL12）和抗炎因子（IL-10）[60]。

3.5 降低膽固醇

膽固醇的積累會導致心血管疾病，危及人們生命安全[61]。降膽固醇藥物能控制血清中的膽固醇，但會產(chǎn)生副作用。近年來乳酸菌EPS降低血液膽固醇水平的研究引起了廣泛關注。據(jù)報道，添加0.1%副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）M7產(chǎn)生的EPS可在25 ℃、20 min后將膽固醇（30 μg/mL）溶液中的膽固醇降低至70.78%[19]。從植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）RJF4中提取的EPS可將膽固醇（30 μg/mL）溶液中的膽固醇降低到42.24%[62]。從發(fā)酵乳中分離出的糞腸球菌（Enterococcus faecium）F1產(chǎn)生的EPS可將膽固醇（30 μg/mL）溶液中的膽固醇降低48.81%[63]。

3.6 預防糖尿病

糖尿病是由糖代謝異常導致血糖濃度升高危害人體健康的疾病[64]。抗糖尿病藥物如阿卡波糖、伏格列糖、米格列醇等會引起腹脹、腸紊亂和腹瀉，不適用于胃腸道疾病患者[20]。因此，用EPS替代當前藥物治療具有重要的現(xiàn)實研究意義。有報道從植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）H31中獲得的HePS可降低胰島素抵抗HepG2細胞株中α-淀粉酶的表達，增加GLUT-4、AKT-2和AMPK的基因表達，促進細胞對葡萄糖的吸收[65]。隨著EPS H31-2的濃度從10-2降至10-8mol/L處理胰島素抵抗的HepG2細胞增加了基因GLUT-4、AMPK和AKT-2的表達，增加葡萄糖消耗，EPS表現(xiàn)出良好的降血糖活性[65]。

3.7 抗病毒活性

病毒性疾病的治療一般是接種疫苗、化學預防和化療。除此之外，利用益生菌微生物及其代謝產(chǎn)物對抗病毒是一種新的方法手段。研究表明乳酸菌通過多種機制發(fā)揮抗病毒活性，如與病毒直接作用、產(chǎn)生抑制物質或刺激免疫系統(tǒng)對抗病毒[66]。有研究報道德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）OLL1073R-1產(chǎn)生的EPS可上調豬腸上皮細胞IFN-α、IFN-β、MxA和RNase L等干擾素基因的表達，使其抗病毒活性顯著提高[67]。由乳酸菌、明串珠菌屬和片球菌屬所產(chǎn)生的EPS對人類的5型腺病毒具有較強的拮抗活性[68]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）產(chǎn)生的EPS能抑制豬睪丸上皮細胞系中的傳染性腸胃炎冠狀病毒增殖[69]。

3.8 抗生物膜活性

乳酸菌EPS通過減弱細胞表面修飾或減少細胞間的相互作用來抑制細菌的聚集和附著[70]。對由致病菌生物膜引起的傳染病有治療和預防作用。如嗜酸乳桿菌（Lactobacil lus acidophilus）A4來源胞外多糖（released exopolysaccharide，r-EPS）對腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis），鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）KCCM 11806，小腸結腸炎耶氏菌（Yersinia enterocolitica），綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）KCCM 11321，李斯特菌（Listeria monocytogenes）ScottA和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）均表現(xiàn)出生物膜抑制活性[71]。由羅馬尼亞酸奶中融合魏斯氏菌（Weissella confusa）分泌的葡聚糖對白色念珠菌（Monilia albican）SC5314的生物膜抑制達到70%[72]。

4 乳酸菌EPS的應用

乳酸菌EPS具有優(yōu)良的生物學特性（活性抗氧化活性、免疫活性、抗病毒活性）與理化特性。這些特性使其具有很強應用潛力。在食品加工中，EPS可作為增質劑、穩(wěn)定劑、增粘劑、生物增稠劑或乳化劑[73]。EPS由于與食物成分相互作用，影響發(fā)酵產(chǎn)品的流變學特性和質地[74]。如在酸奶工業(yè)中，乳酸菌EPS與蛋白相互作用形成網(wǎng)絡結構，改善酸奶粘彈性能，提高保水能力[75]。ANGELIN J等[30]報道稱，由明串珠菌屬（Leuconostoc）和片球菌屬（Pediococcus claussen）株生產(chǎn)的EPS熔點（224 ℃）高，能使乳制品在進行熱處理（殺菌）時保持穩(wěn)定，且熱穩(wěn)定性是乳制品行業(yè)的重要特征。

另一方面EPS具有優(yōu)良的機械強度、生物相容性和生物降解性，可以作為天然的基質材料，開發(fā)運用于生物支架、藥物包埋等生物醫(yī)藥領域。此外，其還具有生物降解性、生物粘附性、離子、pH值和溫度敏感性等眾多特性，因此也被廣泛應用于藥物的靶向遞送[76]。如氧化后的右旋糖酐（醛）和聚L-賴氨酸與席夫堿之間作用形成了一種潛在的外科生物粘合劑[77]。WON K K等[78]開發(fā)了結冷膠水凝膠包埋軟骨細胞，用于軟骨再生。GAO F等[79]研究報道，組裝的EPS納米顆粒裝載抗癌藥物如表阿霉素，在荷瘤小鼠的中增加藥物攝入，表現(xiàn)出持續(xù)釋放模式，使腫瘤體積減少70%。EPS可作為抗原載體或抗原用于制備疫苗[76]。例如，疏水性的羧甲基普魯蘭糖的微粒可有效捕獲破傷風類毒素并進行清除[80]。流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）B型莢膜多糖可以被特異性抗體識別，激活體液免疫產(chǎn)生抗體可以被用作預防兒童各種感染（如腦膜炎）的多價疫苗的重要成分[81]。

在其他方面，對EPS進行修飾，使其帶上一些配體基團，應用于醫(yī)學成像、診斷和治療等領域。如通過氨基修飾普魯蘭糖可增加腫瘤細胞中的熒光強度[82]。許多基于EPS的多功能顯像劑已被開發(fā)用于診斷性磁共振（diagnostic magnetic resonance，DMR）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission to mography，PET）成像，熒光分子斷層掃描（fluorescence molecular tomography，F(xiàn)MT）。如超順磁性氧化鐵納米顆粒與交聯(lián)葡聚糖涂層（cross-linked dextran coating，CLIO）的結合，這種CLIO可與光敏劑一起用作光動力治療的治療劑，可對頸動脈中的動脈粥樣硬化細胞進行照射殺傷[83]。

目前部分乳酸菌EPS已經(jīng)應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)，且展現(xiàn)出優(yōu)良的特性，是一種有巨大潛力的新材料。

5 總結與展望

乳酸菌EPS結構豐富，來源廣泛，且具有豐富的物理活性和生物活性，能廣泛應用于食品，醫(yī)藥化妝品等行業(yè)，是一種具有很大潛力的生物材料。乳酸菌EPS的活性與其結構密切相關，如組成EPS的單糖種類、數(shù)量與比例，分子質量大小，支鏈數(shù)量，官能團種類等。且乳酸菌EPS的產(chǎn)量受到環(huán)境條件（溫度和pH）、底物和乳酸菌本身等多種因素的影響。目前EPS的應用主要受限于產(chǎn)量低與產(chǎn)出質量不穩(wěn)定。隨著對EPS生成途徑的不斷研究，EPS合成途徑越來越清晰。這將有利于人為控制EPS的產(chǎn)生，使其大規(guī)模應用成為可能。但是，不同的菌株產(chǎn)生的EPS結構不同，其生物學效應也不同，目前發(fā)現(xiàn)的乳酸菌EPS的構效關系尚不明確，這些都是新的EPS大規(guī)模應用的障礙。因此，需要對EPS結構和其活性進行詳細的研究說明，對精準控制產(chǎn)生的EPS的理化性質具有重要意義。同時，開發(fā)出有效的方法來獲得特定的結構穩(wěn)定的EPS是非常必要的。上述問題的解決也是未來乳酸菌EPS研究方向及熱點，其將促進EPS在很多領域如醫(yī)療治療、食品加工和環(huán)境研究等發(fā)揮出更大的應用潛力。