茶樹土壤耐高溫多功能溶磷生防凝結芽孢桿菌及其抑制茶樹炭疽病原活性研究

姜春玲，韓姝禎，張政雄,3*

(1.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002；2.寧德師范學院 生命科學學院；3.科技廳產學研合作示范基地，福建 寧德 352100)

在我國，茶種植和相關產業鏈是國家所提倡的科技下鄉、精準扶貧及鄉村振興等的重要產業之一[1,2]。但隨著我國各地的茶樹栽培面積隨年逐漸增加，茶樹種植品系過少，過度使用化學肥料和農業等原因，造成各地茶園的各種霉菌病害日益嚴重，嚴重影響了各種品系茶葉或茶油的產量和品質，也同時限縮和制約茶葉相關產業的發展和營收，尤其以茶樹炭疽病（Gloeosporium sp.and Colletotrichum sp.）較為好發且嚴重的茶樹霉菌病害，在我國各地茶樹種植產區均有出現或暴發疾病，尤其在高溫潮濕的季節或年份，發病情況更為頻繁嚴重，影響茶農收益和茶產業獲利甚巨[3,4]。

本研究擬找尋具有高抑制多種茶樹炭疽病原活性的耐高溫多功能溶磷生防微生物，其耐高溫生長特性可應用于生物肥料制作[5,6]，而中溫特性則可施放于茶園田間和幫助茶樹等植物的生長和對抗多種茶樹炭疽病原的入侵和感染[7]。因此也擬應用這些耐高溫多功能溶磷生防微生物于肥力豐富、高可溶性磷濃度及強抑制多種茶樹炭疽病原活性的多功能生防生物磷肥的制備、工業化量產及商品化，深具有機農業、資源回收、環境保護、綠色有機茶業等永續經營發展的應用價值。

1 材料與方法

1.1 供試耐高溫多功能溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株

供試耐高溫多功能溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株為凝結芽孢桿菌分離株Bacillus coagulans isolate ppx-13，分離自福建省福鼎市福建品品香茶業有限公司管陽河山茶園的福鼎白茶茶樹根際土壤，采樣日期為2021年01月23日[7]。

1.2 供試茶樹炭疽病原分離株

供試茶樹炭疽病原分離株為茶樹炭疽病霉菌病原分離株N425、茶樹炭疽病霉菌病原分離株ZN81及油茶炭疽病霉菌病原分離株DH9，均為本實驗室于我國各地茶園中患茶樹炭疽病的茶樹病葉上所分離出。

1.3 中溫和耐高溫溶磷活性偵測

分別以PVK培養基、以磷礦石為唯一磷源的改良式PVK培養基及以植酸鈣為唯一磷源的改良式PVK培養基平板檢測法于25和50℃培養5天后偵測供試耐高溫微生物的中溫和耐高溫溶磷酸鈣、溶磷礦石及植酸酶活性[5]。

1.4 中溫和耐高溫酶活性偵測

分別以含可溶性淀粉為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養基、含羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養基、含幾丁質為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養基、含果膠質為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養基、含木聚糖為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養基、三丁酸甘油酯培養基及脫脂奶粉培養基平板檢測法分別于25℃和50℃培養5天后偵測供試耐高溫微生物的中溫和耐高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質酶、果膠質酶、木聚糖酶、脂肪酶及蛋白酶活性[5]。

1.5 中溫抑制茶葉炭疽病病原菌活性測試

以本實驗室所分離茶葉炭疽病病原菌-膠孢炭疽菌N425、茶樹炭疽病霉菌病原分離株ZN81及油茶炭疽病霉菌病原分離株DH9為靶標菌株。其菌絲體液態發酵液以馬鈴薯葡萄糖液態培養基于25℃和200rpm培養5天后收獲得，并以無菌操作方式進行以下實驗操作。于4℃及10,000rpm離心20分鐘下，傾倒上清液取得濕菌絲體細胞沈淀固型物。濕菌絲體細胞沈淀固型物使用2倍重量的無菌生理食鹽水進行重新懸浮，以制備菌絲體懸浮液。取適量約200克的菌絲體懸浮液以組織粉碎機經約10秒-15秒的粉碎后，再以顯微鏡檢計數經此適當粉碎條件的菌絲體懸浮液的菌絲片段數，之后以無菌生理食鹽水進行適當倍數稀釋以制備成每mL約有1×106菌絲片段的菌絲懸浮液。之后在分別涂抹100μL的每mL約有1×106菌絲片段的菌絲懸浮液至營養瓊脂平板（NA）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板（PDA）上，再以平板檢測法于25℃培養5天后，進行供試耐高溫微生物的中溫抑制茶葉炭疽病病原菌活性偵測。

1.6 統計分析

數據以平均值±標準偏差（means±SD）表示。以The Independent-Sample T-Test比較平均值之間差異。以Statistical Analysis System Software在Tukey's Honestly Significant Difference（P=0.05、0.01及0.001）條件下用the General Linear Model using type II sum of squares模式進行the variance homogeneity determination（ANOVA）分析[8]。

2 結果與討論

2.1 多樣性溶磷活性

如表1所示，耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃和50℃培養時，于3種不同溶磷活性偵測培養基上均可生長和表現多樣性溶磷活性，而于50℃培養時優于25℃，指出此菌于高溫時較容易生長和表現多樣性溶磷活性。耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13也有植酸酶活性，因此同時可溶解無機和有機磷源。

表1 耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于25和50℃培養時所表現多樣性溶磷活性

2.2 多樣性酶活性

如表2所示，耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃和50℃培養時，可表現7種分解有機物活性，且于50℃培養時優于25℃，指出此菌于高溫時較容易生長和表現多樣性酶活性。應用耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于茶園土壤，可期有加速有機質分解與碳氮磷循環的功能，有助于土壤養分的流動及提供營養給植物和土壤微生物，進而優化土壤環境和增進土壤生態系的多樣性[7]。接種耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于堆肥或生物肥料中，其所表現的耐高溫生長和多樣性酶活性將可加速堆肥或生物肥料的腐熟，以縮短其工業化量產時間，并可促進養分流動和微生物族群的生長，以提升其肥力和品質[5,6]。

表2 耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于25和50℃培養時所表現多樣性酶活

2.3 抑制多種茶樹炭疽病原活性

如表3所示，耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃培養時，于NA或PDA上均可表現抑制3種茶樹炭疽病原活性，且PDA平板檢測法所得的結果優于NA。此結果指出，在霉菌生長代謝較佳的PDA，高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13仍可表現較佳抑制3種茶樹炭疽病原活性，因可推知在茶園土壤環境適合茶樹炭疽病原生長時，高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13應可對其維持高抑制活性，以保護茶樹不受其侵染。

表3 耐高溫多功能性溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃培養時所表現抑制茶樹炭疽病原分離株活性

3 結論

本研究成功從白茶茶樹根際土壤中分離開發一株耐高溫多功能溶磷生防凝結芽孢桿菌分離株ppx-13，有多樣性中溫和耐高溫溶磷和酶活活性及中溫抑制多種茶樹炭疽病原活性，多種未來可應用于各類非糧農業、食品或禽畜糞等廢棄物以進行茶樹多功能生防生物肥料、生物農藥或各式微生物制劑的開發制備、工業化量產及商品化。