多種天然霉菌毒素污染日糧對肉兔生產性能及肝臟功能的影響

張 璐,竇萌萌,王新芳,包永占,陳寶江,史萬玉,4*

(1.河北農業大學 中獸醫學院,河北 保定 071000;2.河北省畜牧總站,河北 石家莊 050000;3.河北農業大學 動物科技學院,河北 保定 071000;4.河北省獸醫生物技術創新中心,河北 保定 071000)

霉菌毒素污染玉米等農作物是影響全球畜牧養殖業的一個共性問題[1]。2020年各地玉米樣品中霉菌毒素的檢出率高達96%,含有2種及以上霉菌毒素的樣品占86.6%,其中黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)是玉米中檢出率最高并且對動物危害最嚴重的3種毒素[2]。

肝臟是霉菌毒素進行分解代謝的場所,也是霉菌毒素攻擊的靶器官[3]。AFB1暴露增加了奶牛肝細胞中活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的濃度,降低超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。此外,AFB1提高了肝細胞中Caspase 3和Caspase 9的蛋白表達量及凋亡率,最終導致肝細胞凋亡[4]。AFB1暴露激活小鼠肝臟線粒體凋亡途徑,抑制肝臟中Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝反應,致使肝細胞發生凋亡[5];在DON暴露過程中,小鼠肝臟中的ROS和8-羥基-2脫氧鳥苷水平增加,造成了肝臟的氧化應激和DNA損傷狀態[6];ZEN暴露會增加仔豬肝臟脂質過氧化產物的水平,降低SOD、總抗氧化能力(T-AOC)和GSH-Px的活性,并下調肝臟Ⅰ期和Ⅱ期代謝酶mRNA水平,導致肝臟顆粒變性[7];研究顯示,AFB1、DON、ZEN 3者聯合作用升高了小鼠肝臟血漿谷丙轉氨酶(ALT)水平,并出現肝細胞腫大和炎性細胞浸潤的病理變化[8]。

近年來關于霉菌毒素對肝臟的毒性機理研究多集中于單一毒素或毒素純品。然而,養殖實踐中普遍存在的多種天然真菌毒素共同暴露對動物肝臟的損傷作用鮮有報道。故本試驗擬研究不同劑量天然AFB1、DON、ZEN污染日糧對肉兔生產性能及肝臟功能的影響,為臨床防治霉菌毒素的危害提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑試驗所用玉米購自當地飼料市場;谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、MDA、SOD、過氧化氫酶(CAT)均購自南京建成生物工程研究所;AFB1、DON、ZEN、ROS、CYP1A2、CYP2A6、CYP3A4等ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司;Go Taq?PCR Master Mix、Go ScriptTMReverse Transcription System和Eastep?Super總 RNA提取試劑盒均購自Promega公司。

1.2 主要儀器MDF-383E超低溫冷凍箱(日本SANYO Electric Biomedical公司);T10BS25組織勻漿機(IKA公司);Light Cycler?96全自動熒光定量PCR儀(羅氏診斷產品有限公司);SQP 電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司);Multiskan Ascent酶標儀(Thermo)。

1.3 霉變玉米及試驗飼糧制作參照文獻[9]的方法進行修改,完成自然霉變玉米制作。市售玉米粒,加水均勻噴濕置于26℃、50%濕度的恒溫培養箱中,黑暗環境培養15 d。然后將發霉玉米進行高壓滅菌,在65℃下干燥72 h,研磨成細粉,測得玉米中的霉菌毒素含量。

試驗日糧組成及營養水平見表1。各組日糧中AFB1、DON、ZEN的最終質量濃度見表2。根據GB 13078-2017飼料衛生標準,飼料中霉菌毒素最終質量濃度要求AFB1≤20 μg/kg,DON≤1 000 μg/kg,ZEN≤500 μg/kg。高劑量霉變玉米添加組日糧AFB1、ZEN超過國家限量標準,低、中劑量組日糧均符合飼料生產標準。

表1 試驗日糧組成及營養水平 %

表2 霉變玉米和飼料中ZEN、DON、AFB1含量 μg/kg

1.4 動物分組和處理采用單因子試驗設計,將80只30日齡新西蘭肉兔隨機分為4組,每組20只,即空白組(A組)、低劑量組(B組)、中劑量組(C組)、高劑量組(D組)。用自然霉變玉米替代飼糧中的正常玉米,各試驗組霉變玉米替代正常玉米的比例分別為0,1/3,2/3,1(表3)。各組肉兔自由采食飲水,預飼期5 d,正式試驗21 d。于試驗21 d,心臟采血,4℃、3 500 r/min離心10 min,分離血清。并取出肝臟組織稱質量,然后將肝臟組織分為兩部分,一部分用4%的多聚甲醛溶液固定,另一部分于-80℃冷凍保存。

表3 肉兔試驗分組及處理

1.5 生產性能指標的測定每天飼喂前,對各組肉兔進行測質量,記錄體質量、采食量,并計算平均日增體質量(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。

1.6 肉兔血清中AST、ALT、TP、ALB含量測定分離的血清按AST、ALT、TP和ALB生化試劑盒說明書操作,計算血清中各指標含量。

1.7 肉兔肝臟組織中藥物代謝酶含量測定精確稱取0.1 g肝臟組織,加入0.9 mL生理鹽水,制成10%組織勻漿。12 000 r/min離心10 min,保留上清液。用于CYP1A2、CYP2A6、CYP3A4 ELISA 試劑盒操作,計算肝臟組織中藥物代謝酶的含量。

1.8 肉兔肝臟組織中MDA、CAT、SOD和ROS水平測定按MDA、CAT和SOD生化試劑盒說明書進行10%組織勻漿中各指標含量或活性的測定。使用ELISA法檢測肝臟組織中的ROS含量。

1.9 肝臟組織中Nrf2、HO-1、NQO-1、Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2 mRNA水平測定以GAPDH作為內參基因,用RT-PCR法對Nrf2、HO-1、NQO-1、Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2基因轉錄水平進行檢測,序列見表4。反應條件:預變性95℃ 30 s,95℃ 15 s;60℃ 30 s,共40個循環。以2-△△Ct計算各目的基因相對轉錄水平。

表4 引物信息

2 結果

2.1 各組肉兔生產性能的變化由表5可見,與A組相比,B組ADFI和F/G無顯著性差異,C組ADFI顯著降低(P<0.05),D組ADFI極顯著降低(P<0.01);B、C、D組ADG極顯著降低(P<0.01);C、D組F/G極顯著升高(P<0.01)。

2.2 各組肉兔血清AST、ALT、TP、ALB的變化如圖1所示,與A組相比,C、D組肉兔血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.05);TP和ALB水平顯著性降低(P<0.05)。此外,B組顯著升高肉兔血清中AST的含量(P<0.05),顯著降低肉兔血清中TP和ALB的含量(P<0.05)。

表5 各組肉兔ADFI、ADG、F/G的變化

圖1 各組肉兔血清ALT、AST、TP和ALB含量

2.3 各組肉兔肝臟細胞色素氧化酶的變化如圖2所示,與A組相比,B組CYP1A2、CYP2A6水平并無顯著性差異(P>0.05),CYP3A4水平顯著降低(P<0.05);與A組相比,C組中CYP1A2和CYP3A4的含量顯著降低(P<0.05);D組CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4水平均顯著低于A組(P<0.05)。

2.4 各組肉兔肝臟ROS、MDA、SOD和CAT的變化如圖3所示,與A組相比,B組SOD活性顯著下降(P<0.05),ROS、MDA、CAT水平無顯著性差異(P>0.05);C、D組ROS、MDA水平顯著升高(P<0.05);SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05)。

2.5 各組肉兔肝臟Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA表達的變化如圖4所示,與A組相比,B組HO-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),Nrf2和NQO-1 mRNA水平無顯著性差異(P<0.05);C、D組Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA表達水平顯著低于A組(P<0.05)。

圖3 各組肉兔肝臟ROS、MDA含量與SOD、CAT活性

2.6 各組肉兔肝臟Caspase 3、Caspase 9、Bax及Bcl-2表達的變化如圖5所示,與A組比較,B組 Bax mRNA表達顯著增加(P<0.05),Bcl-2 mRNA表達顯著降低(P<0.05);C、D組Caspase 3、Caspase 9和Bax mRNA表達水平顯著高于A組(P<0.05),Bcl-2 mRNA表達水平顯著低于A組(P<0.05)。

圖4 各組肉兔肝臟Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA表達量

圖5 各組肉兔肝臟Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2 mRNA表達量

3 討論

ADFI、ADG、F/G是評價動物生長性能的關鍵指標。有研究表明,飼喂霉變飼料后,肉雞ADG、ADFI的水平顯著降低,而F/G顯著升高[10-12]。本試驗結果表明,與空白組相比,中、高劑量霉菌毒素會顯著降低肉兔的ADFI、ADG水平,升高肉兔F/G水平。這與QU[13]等飼喂天然AFB1、DON、ZEN污染的霉變玉米會降低肉雞ADG水平的結果一致;據分析,這可能是由于霉菌毒素導致飼料適口性差,大大降低了肉兔ADFI和ADG的增長。說明多種天然霉菌毒素污染日糧導致肉兔生產性能下降。

血清中AST、ALT含量能夠反映肝臟損傷情況。當肝細胞損傷時,細胞膜通透性升高,導致血液中AST、ALT含量增高。血清中TP和ALB均由肝臟合成,是衡量肝臟功能的重要指標。ISMAIL等[14]發現,日糧中添加AFB1可增加肉兔血清中AST和ALT的活性。SUN等[15]研究發現,飼喂AFB1、DON、ZEN可升高小鼠血清中AST、ALT的水平,降低TP、ALB水平。本試驗結果表明,中、高劑量霉菌毒素組肉兔血清中ALT、AST水平顯著高于空白組,TP、ALB水平顯著低于空白組。這說明天然霉菌毒素污染日糧阻礙肉兔肝臟正常的生理功能,造成肝臟損傷。

霉菌毒素在肝臟中主要經CYP1A2、CYP2A6、CYP3A4進行代謝,因此其代謝酶的含量直接影響肝臟解毒的能力[16-17]。本試驗發現,AFB1、DON、ZEN聯合作用顯著降低肉兔肝臟中CYP1A2、CYP2A6、CYP3A4含量,說明由于肝臟代謝霉菌毒素需要消耗大量的藥物代謝酶,最終導致其含量顯著低于空白組。其中,霉菌毒素組肉兔肝臟CYP1A2、CYP3A4含量與空白組差異最為顯著,可能是由于CYP1A2、CYP3A4主要負責將AFB1活化為AFB1-8,9-環氧化物、黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素Q1,進而毒素累積或排出體外[18]。而本試驗所用的霉變飼料中AFB1相比于ZEN、DON超標較為嚴重,所以導致此結果。

CYP450酶系代謝霉菌毒素生物進程中產生毒性副產物ROS,它可使細胞質中的Nrf2易位到細胞核與抗氧化反應元件結合,下調抗氧化酶HO-1和NQO-1基因的表達并抑制SOD、CAT活性,阻礙自由基的清除,造成細胞損傷[19-21]。此外,當ROS作用于脂質發生過氧化反應,形成終產物MDA,破壞蛋白質、核酸結構和功能[22]。LIU等[23]研究發現,日糧中添加AFB1會下調肉鴨肝臟中Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA的表達水平;大量研究表明,DON、ZEN 均能單獨引起細胞氧化損傷并顯著下調Nrf2通路的下游基因HO-1和NQO-1 mRNA的表達[24-25]。本試驗結果表明,中、高劑量的霉菌毒素降低了肉兔肝臟內Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA的水平。ZHANG等[26]發現,飼喂天然黃曲霉毒素污染日糧引起肉鴨血清抗氧化酶SOD和GSH-Px活性顯著下降;HOU等[27]表明,天然AFB1、ZEN、DON污染日糧導致小鼠血清中MDA水平升高,肝臟組織SOD、CAT活性降低。本試驗結果顯示,霉菌毒素顯著抑制肉兔肝臟中SOD和CAT酶活性,增加肝臟ROS和MDA含量。這說明AFB1、DON、ZEN通過抑制肉兔肝臟Nrf2途徑的關鍵基因,降低抗氧化酶SOD、CAT活性,引起肝臟氧化應激狀態。

霉菌毒素介導肝臟氧化應激反應,產生大量ROS導致細胞凋亡[28-30]。榮雪等[31]發現,DON和ZEA聯合暴露28 d,斑馬魚肝臟Bax與Bcl-2基因比值和Caspase 3基因表達顯著提高,Bax和Caspase 9蛋白表達顯著上調;高億清等[32]發現,飼喂霉菌毒素日糧的仔豬空腸上皮細胞凋亡率顯著升高,Bax和 Caspase 3 mRNA 表達量明顯增加。本試驗結果顯示,與空白組相比,AFB1、DON、ZEN提高肉兔肝臟內促凋亡基因Caspase 3、Caspase 9、Bax的表達水平并且降低抑凋亡基因Bcl-2的表達水平。這表明AFB1、DON、ZEN引起肉兔肝臟的細胞凋亡現象。

本研究發現不同劑量天然AFB1、DON、ZEN污染日糧均可造成肉兔肝臟損傷進而降低生產性能:AFB1、DON、ZEN利用肝臟細胞色素酶CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4代謝,導致毒性產物ROS、MDA過量累積,并抑制抗氧化酶SOD、CAT活性及Nrf2通路相關基因表達,介導氧化應激反應,促使Caspase 3、Caspase 9和Bax表達上調,Bcl-2表達下調,造成肝細胞凋亡,進而損傷肝臟功能,抑制肉兔生長。