一起由產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌引起的母豬流產(chǎn)

章 凡,米日古麗·買(mǎi)吐送,王浴光,張芷源,胡卉琪,陳 潔,劉怡寧,郭昌明*,王新平,2*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062;2.吉林大學(xué) 人獸共患病研究所 教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130062)

豬繁殖障礙已成為嚴(yán)重制約規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)健康發(fā)展的常見(jiàn)疫病,通常臨床上表現(xiàn)為母豬妊娠中斷、胎兒發(fā)育不全或早產(chǎn),大多數(shù)仔豬在出生后不久即死亡。發(fā)生流產(chǎn)不僅降低了母豬的產(chǎn)仔率,而且對(duì)母豬的健康也有不利影響。導(dǎo)致母豬生殖障礙的原因復(fù)雜多樣,其中主要由病毒或細(xì)菌等病原體感染引起。常見(jiàn)的病原包括豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病病毒(PRV)、乙型腦炎病毒(JEV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬衣原體、布魯菌感染等,這些病原感染會(huì)損害豬的生殖系統(tǒng),導(dǎo)致繁殖功能障礙[1-2]。

多殺性巴氏桿菌 (PasteurellaMultocida,Pm) 屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬的成員,是一種重要的人畜共患病病原,可感染多種動(dòng)物。豬感染后主要表現(xiàn)呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病[3]。豬巴氏桿菌病廣泛流行于世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū),其病原菌可與多種病原協(xié)同感染,導(dǎo)致豬群發(fā)生呼吸道疾病并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。有學(xué)者根據(jù)Pm莢膜多糖的不同將其分為A、B、D、E、F 5個(gè)血清型[6],其中A型和D型可以產(chǎn)生毒素,又被稱(chēng)為產(chǎn)毒性多殺性巴氏桿菌 (ToxigenicPasteurellamultocida,T+Pm)[7]。

本研究針對(duì)2021年3月吉林省某規(guī)模化豬場(chǎng)暴發(fā)的一種臨床主要以母豬發(fā)生流產(chǎn)為主要特征的疫病,通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床觀察、病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)室檢查,確定該場(chǎng)暴發(fā)的疫病是由豬產(chǎn)毒素性多殺性巴氏桿菌引起,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集及病理學(xué)檢查吉林省長(zhǎng)春市某新建規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)于2021年3月起暴發(fā)了一種母豬流產(chǎn)為主要臨床特征的疫病。記錄本次暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查并對(duì)送檢流產(chǎn)胎衣和流產(chǎn)胎兒(共計(jì)4頭)進(jìn)行病理學(xué)檢查及潛在病原體檢測(cè)。流產(chǎn)胎衣水腫,流產(chǎn)胎兒皮膚表面和皮下有出血點(diǎn)或出血斑。實(shí)質(zhì)器官無(wú)明顯病變。無(wú)菌采取病料如心臟、肝臟、肺臟、腎臟、腦、脾臟、胎盤(pán)等器官,用于病原分離與檢測(cè)。

1.2 主要試劑TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。LB培養(yǎng)基、抗生素藥敏試劑紙片、微量生化管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成參考TOWNSEND等[8]報(bào)道的多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt1和莢膜血清型基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJf設(shè)計(jì)引物血清型A、B、D、E型。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 鑒別巴氏桿菌莢膜分型引物

1.4 病毒及布魯菌檢測(cè)以常規(guī)方法提取流產(chǎn)胎兒組織中RNA,合成cDNA,并以合成的cDNA為模板,進(jìn)行PPV、PRV、CSFV、JEV、PCV2、PRRSV與布魯菌基因片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增上述病毒所用引物參照文獻(xiàn)[9-11]合成,布魯菌所用引物參照文獻(xiàn)[12]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

1.5 病原分離將上述病料直接涂片,進(jìn)行革蘭染色,然后鏡下觀察有無(wú)細(xì)菌及其形態(tài)。同時(shí),將病料無(wú)菌劃線(xiàn)接種于含1%血清LB培養(yǎng)板上,37℃培養(yǎng)12～18 h,觀察菌落形態(tài)、顏色、大小情況。挑取差異明顯的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12～18 h。

1.6 病原生化特性鑒定將上述細(xì)菌培養(yǎng)物接種于不同的生化特性鑒定試管,37℃培養(yǎng)12～18 h,觀察結(jié)果。

1.7 病原對(duì)抗生素的敏感性試驗(yàn)取少量菌液滴到LB培養(yǎng)板上,涂布均勻后貼上藥敏紙片,37℃培養(yǎng)12～18 h,記錄每種抗生素對(duì)細(xì)菌的抑菌作用及抑菌藥敏圈直徑,根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.8 致病性試驗(yàn)將ICR母鼠隨機(jī)分為5組試驗(yàn)組和1組對(duì)照組,每組10只。取對(duì)數(shù)期細(xì)菌,PBS調(diào)整菌液至5個(gè)稀釋度,以每只0.1 mL的量接種試驗(yàn)組;對(duì)照組腹腔注射等量PBS。連續(xù)觀察7 d,同時(shí)解剖觀察死亡實(shí)驗(yàn)小鼠的病理變化和無(wú)菌采集臟器,進(jìn)行涂片鏡檢和細(xì)菌分離鑒定。

1.9 PCR擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA基因及序列測(cè)定分析取LB細(xì)菌培養(yǎng)物1 mL,5 000 r/min離心3 min后棄上清,用100 μL四餾水將細(xì)菌重新懸浮起來(lái),95℃處理10 min后,取上清用于PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃ 10 min;95℃ 30 s,退火30 s,72℃延伸60 s,共36個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物測(cè)序,并將結(jié)果用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查與病理學(xué)觀察結(jié)果吉林省某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)為2020年12月投入生產(chǎn)的新建豬場(chǎng),于2020年12月分別從天津與沈陽(yáng)兩地購(gòu)買(mǎi)了長(zhǎng)白種豬,共計(jì)1 200頭。1 200頭母豬均為后備頭胎初產(chǎn)母豬。2021年1-2月豬群平穩(wěn),沒(méi)出現(xiàn)明顯發(fā)病疫情。2021年3月上旬,豬群開(kāi)始發(fā)病,后備豬群出現(xiàn)跛行和瘸腿,發(fā)病率為10%,無(wú)死亡,治療效果不佳,發(fā)病豬采取淘汰處理。發(fā)病后,疫情時(shí)有起伏。2021年3月中旬,后備豬群出現(xiàn)脹氣與嚴(yán)重腹瀉,每天有30頭左右發(fā)病,疫情共持續(xù)18 d,發(fā)病率為15%,病死率為2%,腹瀉以血便為主,發(fā)病前期高燒、不食、脹肚,并伴有黃色腹瀉,一般第2天就開(kāi)始腹瀉帶血呈黑色糊狀,治療困難,多采取緊急淘汰處理。2021年3月下旬又出現(xiàn)流產(chǎn)疫情,流產(chǎn)持續(xù)發(fā)病15 d,配種后備母豬共流產(chǎn)74窩,流產(chǎn)日齡為35～65 d,流產(chǎn)前一般表現(xiàn)食欲差,通常第2天就發(fā)生流產(chǎn),流產(chǎn)后母豬會(huì)很快恢復(fù)采食、體溫也恢復(fù)正常。該段時(shí)間整個(gè)豬群的返情率高達(dá)25%。流產(chǎn)胎兒病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示,流產(chǎn)胎兒皮膚表面和皮下有出血點(diǎn)或出血斑、胎衣水腫(圖1)。

A.流產(chǎn)胎兒皮膚表面和皮下有出血點(diǎn)或出血斑;B.流產(chǎn)胎衣水腫

2.2 病毒及布魯菌的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用PCR對(duì)流產(chǎn)胎兒組織樣品可能存在的病毒及布魯菌進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果未檢出PPV、PRV、CSFV、JEV、PCV2、PRRSV和布魯菌。

2.3 病原的分離將流產(chǎn)病料直接涂片進(jìn)行革蘭染色,鏡檢可見(jiàn)到革蘭陰性菌(圖2A)。將病料接種1% 血清培養(yǎng)板培養(yǎng)18 h后,可見(jiàn)各種菌落聚集,觀察菌落形態(tài)并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),在1% LB平板上分離到1種0.5～1.5 mm的灰白色菌落(圖2B)。且從4頭流產(chǎn)胎兒的病料中均分離到了該種菌。

挑取單個(gè)菌落增菌后,涂片染色鏡檢,可見(jiàn)大量革蘭陰性短球桿菌,細(xì)菌邊緣界限清楚,偶見(jiàn)兩端濃染的短小桿菌,與巴氏桿菌形態(tài)特征相符,并與圖1中細(xì)菌一致(圖2C)。

2.4 病原生化鑒定結(jié)果顯示分離菌株可以發(fā)酵果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇;不能發(fā)酵麥芽糖、乳糖;過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗(yàn)表現(xiàn)陽(yáng)性,甲基紅(MR)和二乙酰(VP)試驗(yàn)陰性。該分離菌符合多殺性巴氏桿菌生化特征。

2.5 分子生物學(xué)診斷應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA,序列測(cè)定與比對(duì)結(jié)果顯示分離菌株為多殺性巴氏桿菌。致病菌莢膜分型的PCR鑒定結(jié)果顯示:Pm-CC21屬于莢膜多糖基因型D型(圖3)。

A.流產(chǎn)仔豬腦組織涂片鏡檢革蘭染色(1 000×);B.分離菌在1% LB平板上的菌落形態(tài);C.分離菌純培養(yǎng)物革蘭染色(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker;1～5.分別為kmt1、hya D-hya C、bcb D、dcb F、ecbJf的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.6 藥敏試驗(yàn)測(cè)量記錄每種抗生素抑菌直徑,根據(jù)抑菌直徑的大小將抗生素分為敏感(S)、中敏(I)或耐藥(R)。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 Pm-CC21菌株對(duì)小鼠的致病性用腹腔注射的方法進(jìn)行動(dòng)物攻毒,用改良寇氏法計(jì)算出Pm-CC21菌株的半數(shù)致死量為2.2×105CFU。剖檢死亡小鼠可見(jiàn)脾臟出現(xiàn)壞死灶,大腦充血,肺臟水腫,表面有出血點(diǎn)(圖4)。無(wú)菌采集病變器官,涂片,革蘭染色后鏡檢,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的革蘭陰性菌,與送檢流產(chǎn)胎兒病料檢測(cè)的結(jié)果相同。對(duì)照組小鼠飼養(yǎng)1周后全部存活,剖檢未見(jiàn)病變,也未分離到細(xì)菌(圖5)。

表2 細(xì)菌分離物對(duì)不同抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

A.脾臟出現(xiàn)壞死灶;B.大腦充血;C.肺臟水腫、表面有出血點(diǎn)

A.脾臟;B.腦組織;C.肺臟

3 討論

引起母豬繁殖障礙的因素較為復(fù)雜,其中較為常見(jiàn)的病原有PPV、PRV、CSFV、JEV、PCV2、PRRSV和布魯菌感染等,這些病原感染不同期懷孕的母豬可導(dǎo)致母豬妊娠中斷和早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱胎等,大多數(shù)胎兒在出生后不久即死亡[1]。本研究對(duì)送檢樣本進(jìn)行了PRV、JEV、PPV、PCV2、CSFV和PRRSV病毒核酸的檢測(cè),結(jié)果未檢測(cè)出上述病毒,排除了這些病毒作為引起臨床上以母豬流產(chǎn)和早產(chǎn)為特征疫病的病原體。同時(shí),本試驗(yàn)從流產(chǎn)胎衣和胎兒器官中未檢測(cè)分離到布魯菌,排除了該菌在此次疫情暴發(fā)中的作用。細(xì)菌鏡檢與分離結(jié)果顯示,從送檢流產(chǎn)胎衣和流產(chǎn)胎兒實(shí)質(zhì)器官中觀察及分離出1種革蘭陰性小桿菌,核苷酸序列測(cè)定與分析結(jié)果證實(shí)分離的細(xì)菌為多殺性巴氏桿菌,說(shuō)明巴氏桿菌可能是引起此次疫情的病原體。

多殺性巴氏桿菌是一類(lèi)重要的人獸共患致病菌,感染后可引起多種動(dòng)物以及人類(lèi)發(fā)病[13]。引起動(dòng)物感染的多殺性巴氏桿菌主要流行株為莢膜A、B、D型[14]。其中A型引起豬肺疫,B型引起牛出血性敗血癥,D型引起豬傳染性萎縮性鼻炎和流產(chǎn)[15]。本研究應(yīng)用PCR技術(shù),對(duì)分離菌株進(jìn)行了莢膜分型,結(jié)果顯示Pm-CC21屬于莢膜多糖基因型D型,與文獻(xiàn)報(bào)道的D型莢膜可以引起流產(chǎn)結(jié)果一致[15],進(jìn)一步確定了該豬場(chǎng)暴發(fā)的臨床上與母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)為特征的疫病由多殺性巴氏桿菌引起。雖然由巴氏桿菌引起的母豬發(fā)生流產(chǎn)與早產(chǎn)的報(bào)道并不多見(jiàn),但本研究確定的由多殺性巴氏桿菌引起母豬流產(chǎn)與早產(chǎn)的報(bào)道,應(yīng)該引起國(guó)內(nèi)同行從業(yè)人員的重視。

本研究對(duì)吉林省某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)暴發(fā)的一種臨床上以流產(chǎn)為特征的疫病進(jìn)行了調(diào)查。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室病原分離與系統(tǒng)鑒定,確定了引起此次疫情的病原體為多殺性巴氏桿菌。同時(shí)依據(jù)菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合其他綜合性防控措施,有效地控制了疫情的擴(kuò)散,該結(jié)果為今后防控多殺性巴氏桿菌感染提供了重要的參考價(jià)值。