鴨源雞桿菌的藥物敏感性及其對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制

皇甫和平,賈含笑,2,孫彥婷,薛通通,彭志鋒,王宏魁,董 青,曹素芳*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis,G.anatis)是一種存在于雞上呼吸道和下生殖道的條件致病菌,與產(chǎn)蛋雞輸卵管炎和腹膜炎關(guān)系密切,可造成產(chǎn)蛋量下降和感染禽的高致死率,被認(rèn)為是引起家禽呼吸道和生殖道病變的主要原因之一[1-2]。近年來,關(guān)于G.anatis多重耐藥現(xiàn)象的報道逐漸增多[3-6],同時由于該菌具有豐富的抗原多樣性[1,7-8],從而使得采用藥物和疫苗防治G.anatis感染效果不佳。現(xiàn)階段,采取嚴(yán)格的生物安全措施,對該菌進行耐藥監(jiān)測,了解其藥物敏感性和耐藥機制,指導(dǎo)臨床合理用藥,仍然是控制這一疾病的可靠辦法。

為了解近年來國內(nèi)G.anatis的藥物敏感性,本研究以實驗室保存的204株G.anatis為對象,檢測該菌的耐藥情況。鑒于研究中發(fā)現(xiàn)這些G.anatis有高水平的氟喹諾酮類耐藥性,有必要開展相應(yīng)耐藥機制的研究。氟喹諾酮類藥物是人獸共用抗菌藥物,近些年被廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。因此,細(xì)菌進化出了多種耐藥機制來適應(yīng)這種藥物選擇壓力,相關(guān)研究主要集中在2個方面:一是染色體基因組上的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR)突變導(dǎo)致耐藥[9-11];二是質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥[12-15]。QRDR突變是細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的最主要原因[9-10],因此本試驗擬通過檢測實驗室保存的G.anatis中QRDR存在的突變位點,分析不同突變位點在氟喹諾酮類耐藥中的作用,以揭示G.anatis分離株對氟喹諾酮類藥物高度耐藥的分子機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑ETC-811 PCR儀購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;3-30K高速冷凍離心機購自德國Sigma公司;DW-HL398 -80℃超低溫冰箱購自中科美菱低溫科技股份有限公司。4S Green核酸染料、DNA Marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司;綿羊血瓊脂平板購自鄭州福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司;藥敏紙片氨芐西林(AMP)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(CN)、妥布霉素(TOB)、四環(huán)素(TE)、左氧氟沙星(LEV)、頭孢曲松(CRO)、阿米卡星(AK)、頭孢噻肟(CTX)、復(fù)方新諾明(SXT)和氧氟沙星(OFX)購自英國Oxoid Limited公司;麥?zhǔn)媳葷峁苜徸员本┨彀猜?lián)合科技有限公司;DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 菌株204株G.anatis由本實驗室保存,其中包括從河南、山西、山東、湖北、陜西和上海市等地的養(yǎng)禽場或動物醫(yī)院分離的192株,以及由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室惠贈的12株?；揪晷畔⒁姳?。

1.3 引物參照文獻[16]的方法,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成gyrA、parC基因PCR引物,引物序列見表2。

1.4 藥物敏感性試驗根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)(M45),按照常規(guī)K-B紙片法,采用11種藥物對204株G.anatis進行藥物敏感性試驗。

1.5gyrA、parC基因的擴增及測序取細(xì)菌LB肉湯培養(yǎng)物1 mL加入1.5 mL離心管中,10 000 r/min離心5 min,棄上清,加入600 μL的TE 緩沖液吹打混勻,100℃沸水浴10 min,立即冰浴2 min,12 000 r/min離心10 min,取上清立即使用,或-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

選取其中30株G.anatis進行g(shù)yrA、parC基因的PCR擴增。反應(yīng)體系(25 μL):TaKaRa Ex Taq 0.125 μL,dNTP 2.0 μL,Ex Taq buffer 2.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板DNA 1 μL,滅菌超純水17.375 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃ 1 min,52℃ 50 s,74℃ 50 s,30個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序成功后上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。

表1 G.anatis菌株基本信息

表2 gyrA、parC基因引物

1.6gyrA、parC基因QRDR編碼氨基酸突變分析從30株試驗菌株中選取對環(huán)丙沙星耐藥和敏感的G.anatis菌株,與GenBank收錄的G.anatis、E.coli一并進行分析。使用DNAStar、Clustalx 1.81軟件,分別對上述菌株的gyrA、parC基因序列進行比對,分析其QRDR編碼氨基酸的突變情況。30株G.anatis和其他用于比較菌株的信息見表3。

2 結(jié)果

2.1 204株G.anatis的藥物敏感性204株G.anatis對11種藥物的敏感性結(jié)果見表4和圖1。結(jié)果顯示,11種藥物中有9種的耐藥率達40%以上,其中環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素和氨芐西林的耐藥率達84.80%以上;慶大霉素、阿米卡星、頭孢噻肟和頭孢曲松的敏感率較高,分別為57.35%,48.53%,39.22%,37.25%。

多重耐藥情況見表5和圖2。結(jié)果顯示,耐3種以上藥物的菌株有202株,占比99.02%;耐6種以上藥物的菌株有188株,占比92.16%,其中有6株對所選的11種藥物全部耐藥。

2.2 30株G.anatisgyrA和parC基因的PCR擴增和測序通過gyrA基因PCR擴增,30株G.anatis中有22株擴增出約433 bp預(yù)期DNA片段,部分菌株的電泳結(jié)果見圖3;通過parC基因PCR擴增,30株G.anatis均擴增出約418 bp預(yù)期DNA片段,部分菌株的電泳結(jié)果見圖4。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA測序,測序結(jié)果上傳至GenBank,登錄號見表6。

表3 用于氟喹諾酮類藥物耐藥基因分析的有關(guān)菌株信息

表4 藥物敏感性試驗結(jié)果

圖1 204株G.anatis對11種藥物的耐藥比例

2.3gyrA、parC基因QRDR序列比對結(jié)果表6中F149T為環(huán)丙沙星敏感菌株,其余實驗室收集的G.anatis為環(huán)丙沙星耐藥菌株。將同時檢測出gyrA和parC基因的22株菌,與表6中GenBank收錄的其他G.anatis和E.coli參考菌株,進行GyrA和ParC亞基氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn),G.anatis耐藥菌株GyrA亞基存在Ser83→Phe、Asp87→Ala/Tyr/Asn和Asp139→Tyr位點氨基酸的改變(圖5)。G.anatis耐藥菌株P(guān)arC亞基存在Thr84→Ile、Glu88→Gly、Ala94→Val和Gly179→Val位點氨基酸突變(圖6)。

表5 204株G.anatis的多重耐藥情況

圖2 G.anatis多重耐藥柱狀圖

M.DL2000 DNA Marker;1～22.G. anatis 菌株;23.陽性對照;24.空白對照

M.DL2000 DNA Marker;1.空白對照;2.陽性對照;3～24.G.anatis 菌株

圖5 GyrA亞基的QRDR序列比對

圖6 ParC亞基的QRDR序列比對

2.4G.anatis對環(huán)丙沙星的敏感性與其QRDR突變的關(guān)系以同時檢出gyrA和parC基因的22株G.anatis為對象,分析其對環(huán)丙沙星的敏感性與QRDR突變的關(guān)系,上述菌株對環(huán)丙沙星的耐藥表型與QRDR突變情況見表6。由表6可知,對環(huán)丙沙星敏感的菌株F149T沒有發(fā)生氨基酸的替換;中度敏感菌株GAC003、GAC006發(fā)生了3處氨基酸的替換;19株耐藥菌株中,除1株存在3處氨基酸替換外,其余18株菌存在4～5處氨基酸的替換;環(huán)丙沙星耐藥菌株均發(fā)生了GyrA亞基83,87位和ParC亞基84位氨基酸的替換。

表6 22株G.anatis QRDR的突變分析

3 討論

藥感試驗結(jié)果顯示,試驗菌株對氟喹諾酮類藥物、復(fù)方新諾明、四環(huán)素和氨芐西林的耐藥率達到84.80%以上,其中對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明耐藥的菌株占比甚至達到了95.59%以上,只有頭孢曲松與頭孢噻肟的耐藥率較低,分別為11.27%和7.35%,與研究報道[5,17-18]的結(jié)果相似,反映出G.anatis分離株中耐藥性極為普遍。204株G.anatis中,99.02%的菌株耐受3種以上藥物,92.16%的菌株耐受6種及以上藥物,甚至有6株菌對11種藥物全部產(chǎn)生了耐藥性,該結(jié)果進一步驗證了VAN DRIESSCHE等[4]、唐詩等[8]、彭志鋒等[19]的研究結(jié)果,說明該菌作為一種條件致病菌,目前存在嚴(yán)重的多重耐藥性。上述研究結(jié)果一方面為防治G.anatis感染提供了一定的參考;另一方面也提醒人們要高度重視該菌日益嚴(yán)重的耐藥問題,積極探索綠色健康養(yǎng)殖模式,盡量減少養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的應(yīng)用。

G.anatis在國內(nèi)外的家禽中廣泛存在[20-22],2011年BOJESEN等[23]報道墨西哥和丹麥兩個國家23個雞群中分離的46株G.anatis對環(huán)丙沙星耐藥率高達100%;2018年ELBESTAWY等[24]對埃及的102個雞群進行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)從2013-2015年分離的菌株對諾氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥性有所增強。國內(nèi)G.anatis分離株對氟喹諾酮類藥物的耐藥性發(fā)展也很快,2016年彭志鋒[19]報道了61株G.anatis的藥敏試驗,結(jié)果顯示分離株對環(huán)丙沙星的耐藥率達到83.61%。本研究中,G.anatis對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別達到98.04%,95.59%,90.69%,上述研究說明國內(nèi)G.anatis對氟喹諾酮類藥物的耐藥性有愈發(fā)嚴(yán)重之勢,亟需開展相應(yīng)的耐藥機制研究。

本研究通過對22株G.anatis的耐藥表型與基因型的分析發(fā)現(xiàn),耐藥菌株的GyrA亞基上檢測到3個氨基酸位點(Ser83、Asp87和Asp139)的突變,ParC亞基上檢測到4個氨基酸位點(Thr84、Glu88、Ala94和Gly179)的突變,所有的耐藥菌株均發(fā)生了GyrA亞基83,87位和ParC亞基80位氨基酸的突變,推測這3個位點突變對其氟喹諾酮類藥物耐藥性的產(chǎn)生十分重要,很可能起到前提和基礎(chǔ)的作用,而GyrA亞基的139位和ParC亞基88,94,179位氨基酸的突變只存在于部分菌株,非耐藥所必需的,推測有增強耐藥程度的作用。敏感菌株F149T不存在這些位點的突變,中度敏感菌株發(fā)生了3處氨基酸的替換,19株耐藥菌有1株發(fā)生3處氨基酸位點替換,其余18株(94.7%)均發(fā)生4處及以上氨基酸位點的替換,說明QRDR編碼氨基酸發(fā)生突變的數(shù)量與耐藥程度呈正相關(guān)。

G.anatis中QRDR突變導(dǎo)致其對氟喹諾酮類藥物耐藥的機制與其他細(xì)菌類似[10,25-26],但也存在一些差別,在1株耐藥菌株的GyrA亞基上同時存在Asp139→Tyr位點氨基酸的置換,在5株耐藥菌株的ParC亞基上同時存在Gly179→Val位點氨基酸的改變,從而導(dǎo)致相應(yīng)菌株在2個亞基上氨基酸置換達到5處,表明G.anatis分離株QRDR突變正在變得更為復(fù)雜;G.anatisGyrA亞基發(fā)生氨基酸替換的位點(83,87)與大腸桿菌、沙門菌一致,而G.anatisParC亞基發(fā)生替換的位點(84,88,94)與上述其他菌株不一致,對應(yīng)于這些菌株的80,84,90位點[27-29],提醒進行G.anatisQRDR突變分析時應(yīng)該注意。

G.anatis分離株產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥性,對氟喹諾酮類、四環(huán)素和磺胺類等藥物高度耐藥。該菌對氟喹諾酮類藥物的高度耐藥性與QRDR編碼氨基酸位點突變關(guān)系密切,突變位點數(shù)量與耐藥情況呈正相關(guān);在其GyrA、ParC亞基QRDR區(qū)域存在7個突變位點,推測GyrA83、GyrA87和ParC84位氨基酸的突變對氟喹諾酮類藥物的耐藥起著決定性作用,其余4個位點突變起協(xié)同增強作用。