雞MyD88基因對巨噬細胞增殖和凋亡的影響

丁夢霞,朱召巖,于燕鴿,王冰欣,昝瑞隆,田亞東,孫桂榮,韓瑞麗,蔣瑞瑞,康相濤,閆峰賓*

(1.河南農業大學 動物醫學院,河南 鄭州450046;2.河南農業大學 動物科技學院,河南 鄭州 450046)

髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)信號通路中的一個關鍵接頭分子,在傳遞上游信息和疾病發生發展中具有重要的作用[1-2]。Toll樣受體是重要的天然免疫受體家族,是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。現有研究證明,除了TLR3以外,MyD88參與了TLRs家族其他所有成員介導的免疫反應[3]。研究發現,激活MyD88所介導的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,可導致Th1/Th2免疫失衡,破壞機體免疫系統[4]。MyD88活化后能參與調控多條信號通路,從而影響機體的免疫、增殖、凋亡等生理過程[5]。細胞增殖和凋亡是生物生長發育的基礎,雞巨噬細胞(HD11)的增殖和凋亡對維持家禽機體正常的器官結構和免疫功能至關重要。目前有關MyD88的研究多集中在動物感染性疾病、人類腫瘤和小鼠腸道炎,而在家禽中的報道較少。迄今為止,未見MyD88基因在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中作用的相關報道。

在前期研究中,通過轉錄組測序發現MyD88基因在皮質酮(corticosterone,CORT)誘導的雛雞應激模型中通過TLR4/MyD88信號通路對雞的免疫功能具有潛在調節作用[6]。免疫功能的改變會影響動物的生長發育,體內代謝紊亂,改變細胞周期進程,導致細胞異常凋亡等。MyD88作為連接先天性和適應性免疫應答的關鍵信號轉導基因,在人和小鼠方面研究屢有報道,但是,其在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中的作用尚不明確。因此,為探究免疫相關基因MyD88對雞HD11細胞增殖和凋亡的影響,本試驗通過構建MyD88基因過表達載體,以及合成干擾片段,并分別轉染至雞HD11細胞中,為深入解析MyD88基因在雞HD11細胞增殖和凋亡過程中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HD11細胞由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所趙桂蘋教授贈予;RPMI1640培養基和胎牛血清購自Biological Industries(BI)公司;CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;細胞周期檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司;轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen生命技術公司;MyD88過表達載體(pcDNA3.1-EGFP-MyD88)由武漢金開瑞生物工程有限公司構建;MyD88干擾片段(si-RNA)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 HD11細胞的培養將HD11細胞復蘇后置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養,待細胞密度達到90%以上,即可進行細胞傳代,待細胞傳代至F3代,即可用于后續試驗。

1.3 CCK-8檢測細胞活性將HD11細胞均勻鋪在96孔板中,待細胞完全貼壁后根據說明書使用Lipofectamine 2000轉染MyD88過表達質粒(pcDNA3.1-EGFP-MyD88)和干擾片段(si-MyD88)及相應對照pcDNA3.1-EGFP和si-NC,轉染12,24,36,48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h后,采用多功能酶標儀在450 nm波長下檢測細胞吸光度。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期將HD11細胞均勻鋪在12孔板中培養,待細胞完全貼壁后轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒與si-MyD88基因干擾片段和相應的對照,轉染24 h后棄去培養基,1 500 r/min離心4 min,每管加入1 mL預冷的75%乙醇,重懸細胞,4℃固定12 h,離心后,每管加入500 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液,利用流式細胞儀,標準程序下檢測細胞周期,利用FlowJo 7.6軟件分析結果。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡將HD11細胞接種于12孔板中,轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒與si-MyD88基因干擾片段和相應的對照24 h后,棄去培養基,用無EDTA胰酶消化后,2 500 r/min離心2 min,每管加入1 mL PBS清洗2次,取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中,加入5 μL FITC Annexin V(組份 A)和2 μL PI(組份 B),室溫避光反應 15 min,加入 400 μL 1×Annexin-binding buffer,混勻后,用流式細胞儀進行檢測(激發波長:488 nm;發射波長:530 nm)。

1.6 qRT-PCR檢測MyD88對HD11細胞增殖和凋亡標志基因表達水平的影響轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒與si-MyD88基因干擾片段和相應對照36 h后,收集細胞,TRIzol 法提取細胞的總RNA,并反轉錄為cDNA,以cDNA為模板,雞GAPDH基因為內參,采用qRT-PCR檢測增殖和凋亡標志基因CCND1、PCNA、P21和Bax、Caspase 3、Caspase 9、Bcl-2基因的表達變化。引物序列信息見表1。

表1 qRT-PCR引物信息

2 結果

2.1 轉染MyD88基因過表達質粒熒光結果將pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒與pcDNA3.1-EGFP空載體質粒轉染至HD11細胞24 h后,利用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。結果如圖1所示,細胞內均能觀察到EGFP綠色熒光蛋白標簽表達,表明所構建的MyD88過表達質粒能夠正常轉染至HD11細胞,且正常表達EGFP綠色熒光蛋白標簽。

A.HD11細胞形態;B.HD11細胞內表達綠色熒光;C.A與B兩者融合

2.2 MyD88對HD11細胞活性的影響為檢測MyD88對HD11細胞活性的影響,在分別轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒與si-MyD88基因干擾片段及其相應對照后,采用CCK-8檢測各組細胞的活性。結果顯示,與過表達對照組pcDNA3.1-EGFP相比,轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒36,48 h HD11細胞活力顯著下降(圖2A,P<0.05);與NC干擾對照組相比,轉染si-MyD88干擾片段36,48 h HD11細胞活力顯著高于對照組(圖2B,P<0.05)。

A.過表達MyD88對HD11細胞的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞的影響;與對照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 MyD88對HD11細胞周期的影響為檢測MyD88基因對HD11細胞周期的影響,在分別轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒與si-MyD88基因干擾片段及其相應對照后,采用流式細胞術檢測各組細胞的細胞周期分布情況。結果顯示,轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒可顯著增加G2期細胞數(P<0.05),極顯著降低S期細胞數(P<0.01),抑制HD11細胞增殖(圖3A);轉染si-MyD88干擾片段可極顯著降低G1期細胞數(P<0.01),增加S期細胞數(P<0.01),促進HD11細胞增殖(圖3B)。

2.4 MyD88對HD11細胞增殖標志基因mRNA表達水平的影響為進一步確定MyD88對HD11細胞增殖的影響,采用qRT-PCR檢測增殖標志基因CCND1、PCNA和P21的mRNA表達水平。結果顯示,轉染pcDNA3.1-EGFP-MyD88質粒后促增殖標志基因CCND1和PCNA表達水平顯著降低(P<0.05),抑增殖基因P21顯著升高(P<0.05,圖4A);轉染si-MyD88干擾片段可顯著上調促增殖標志基因PCNA的表達(P<0.05),顯著下調抑增殖基因P21的表達(P<0.05,圖4B)。此結果與CCK-8和細胞周期結果一致,進一步說明MyD88基因對HD11細胞增殖具有抑制作用。

2.5 MyD88對HD11細胞凋亡和凋亡相關基因表達水平的影響為檢測雞MyD88基因對HD11細胞凋亡的影響,在分別轉染MyD88過表達質粒和干擾片段及相應對照后,采用流式細胞術和qRT-PCR法檢測MyD88過表達和干擾對細胞凋亡的作用。流式細胞術結果顯示,轉染MyD88過表達質粒和干擾片段及相應對照后,與對照組相比MyD88過表達組凋亡率極顯著升高(P<0.01,圖5A);轉染MyD88基因干擾片段后可與對照組相比可顯著降低HD11細胞凋亡(P<0.05,圖5B)。qRT-PCR檢測結果顯示,轉染MyD88過表達質粒可顯著上調Bax、Caspase 3和Caspase 9基因的表達水平(P<0.05),下調Bcl-2基因的表達水平(P<0.05)(圖6A);轉染MyD88基因干擾片段后可顯著下調Bax和Caspase 9的表達水平(P<0.05,圖6B),結果表明,雞MyD88基因對HD11細胞凋亡具有促進作用。

3 討論

細胞增殖是細胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的前提。當機體受到外界不良刺激時,免疫系統一方面可以通過募集組織中巨噬細胞來增強免疫反應;另一方面,巨噬細胞通過快速增殖和自我更新同樣可以起到增強免疫反應作用[7-8]。細胞增殖是通過細胞周期來實現的,細胞周期調控異常易發生細胞癌變。細胞增殖伴隨多種基因的轉錄和細胞因子的表達,CCND1是細胞周期從G1期到S期通過限制點調節過渡的關鍵把關蛋白[9];PCNA是參與DNA代謝過程的重要蛋白質,阻斷該基因會抑制DNA合成,進而阻滯細胞周期,由于其在復制中的作用而被認為是增殖的分子標記物[10];細胞周期蛋白激酶抑制劑p21可以通過抑制PCNA的活性,誘導DNA損傷,從而引發細胞周期阻滯,抑制細胞增殖[11-12]。大量研究表明,MyD88的表達與腫瘤、癌癥及免疫性疾病有著密切關系。研究發現[13],激活MyD88上游基因TLR7后能夠通過抑制T細胞增殖而發揮抗腫瘤的作用。本研究在轉染MyD88過表達質粒后,通過流式細胞術和qRT-PCR檢測HD11細胞增殖情況,結果發現,MyD88過表達可顯著降低細胞周期中DNA合成期S期的占比率,下調增殖標志基因的表達水平,提示MyD88活化后可通過影響HD11細胞的DNA合成來調控HD11細胞的增殖,從而影響HD11細胞的生長發育。

A.過表達MyD88對HD11細胞增殖標志基因的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞增殖標志基因的影響

A.過表達MyD88對HD11細胞凋亡標志基因的影響;B.干擾MyD88對HD11細胞凋亡標志基因的影響

細胞凋亡可以使免疫細胞由活化狀態進入凋亡狀態,從而降低細胞免疫反應,凋亡是由多種凋亡調節因子嚴格控制的過程,而凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系[14-15]。其中,Bcl-2可防止細胞凋亡,而Bax位于線粒體外膜,能促進線粒體釋放促凋亡因子,引發細胞凋亡[16]。Caspase 9能促進細胞凋亡并參與細胞因子加工[17];Caspase 3是一種常被激活的死亡蛋白酶,參與細胞解體和凋亡小體的形成,被廣泛用作凋亡的生物標志物[18]。研究發現,當使用siRNA敲除TLR4基因后,發現能抑制凋亡基因Caspase 3、Caspase 9和Bax的激活從而防止小鼠心肌凋亡[19]。當細胞中MyD88濃度升高到一定水平時可激活NF-κB的大量分泌,破壞細胞免疫平衡,引起炎癥因子的大量釋放,導致細胞凋亡[20]。本研究通過流式細胞術及qRT-PCR方法檢測過表達和干擾MyD88對HD11細胞凋亡的影響,結果顯示,MyD88過表達后可顯著提高HD11細胞的凋亡率,促進HD11細胞的凋亡;干擾MyD88基因可顯著降低HD11細胞的凋亡率,抑制HD11細胞的凋亡。研究發現[13],激活依賴性MyD88信號通路后能夠促進腎癌細胞和血管內皮細胞凋亡,其機制是通過依賴Caspase和Bcl-2途徑誘導靶基因凋亡。還有研究發現[21],成纖維細胞生長因子21(FGF21)通過抑制MyD88所在的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路來抑制細胞凋亡。這與本研究通過干擾MyD88基因降低HD11細胞凋亡率結果一致。

綜合以上結果推測,MyD88基因能通過在雞HD11細胞中高表達,抑制HD11細胞的DNA合成期來抑制細胞的增殖,阻滯細胞周期進程導致細胞異常凋亡,其機制可能是通過激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,導致HD11細胞產生炎癥反應,從而破壞細胞的免疫平衡。