綿羊CD14基因在臨床型乳腺炎乳腺組織中的表達

范梓文,尹德恩,滿永恒,郭 磊,馬友記*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省動物生殖生理與繁殖調(diào)控重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;3.甘肅省金昌市永昌縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心,甘肅 金昌 737200)

綿羊乳腺炎是對養(yǎng)羊業(yè)有極大影響的一種疾病,哺乳期最易患病[1]。目前,對于哺乳動物乳腺炎的相關(guān)研究主要集中在奶牛[2-3],在病原體[4]、發(fā)病機理[5]、疾病預防[6]等方面研究較為廣泛,而關(guān)于綿羊乳腺炎發(fā)病機理的相關(guān)研究較少。綿羊乳腺炎的發(fā)病率為5%～30%,在少數(shù)暴發(fā)乳腺炎的大規(guī)模集約化羊群中,只有10%的患病母羊存活下來,由此可見,乳腺炎的發(fā)生嚴重制約著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[7]。研究結(jié)果表明,乳腺炎不僅會影響母羊自身的繁殖和生產(chǎn)過程,而且會降低乳制品生產(chǎn)水平和質(zhì)量[8]。患病動物表型發(fā)生改變(如體細胞數(shù)增多、產(chǎn)奶量下降、乳品質(zhì)降低)的主要原因是由于乳腺炎可在細胞水平誘導乳腺組織內(nèi)多種類型細胞的凋亡[9]。本試驗以湖羊為研究對象,湖羊具有四季發(fā)情、泌乳性能較好、多胎高產(chǎn)等優(yōu)點,是我國較為優(yōu)秀的綿羊品種之一[10]。

白細胞分化抗原14 (cluster of differentiation antigen 14,CD14)是近年來備受關(guān)注的多功能炎癥細胞性因子,在炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。通過對哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn),CD14最初是在人體單核細胞的表面被檢測出來,位于人體5號常染色體的長臂端5q23-q31,在細胞內(nèi)的表達是通過GPI固定于細胞膜上,形成55 kD的糖蛋白[12-14],其也在1990年被確定為內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的識別受體[15],作為LPS受體,CD14的主要生物學功能是識別、結(jié)合LPS/LBP復合物,介導LPS性細胞反應(yīng)。當機體發(fā)生革蘭陰性菌等感染源侵入時,CD14識別并結(jié)合LPS后,可激活Toll-like受體4信號轉(zhuǎn)導通路,并進一步介導單核巨噬細胞分泌炎癥因子和共刺激因子的表達,激發(fā)機體炎癥反應(yīng)[16]。當病原菌侵入乳腺,白細胞遷移到乳腺組織提供了第一道防線。在母畜乳腺由健康到患病過程中,白細胞發(fā)揮著重要作用。白細胞依靠表面受體包括趨化因子、CD14等,依靠這些表面受體遷移并黏附內(nèi)皮細胞,發(fā)揮和吞噬功能[17]。白細胞及其表面受體對母畜乳腺炎發(fā)生有著重要的影響。研究表明,母畜分娩前后乳腺的局部及全身免疫防御系統(tǒng)存在缺陷,在對正常母畜與圍產(chǎn)期前后母畜白細胞體內(nèi)和體外功能的研究中發(fā)現(xiàn),分娩前后的母畜與乳腺局部免疫防御系統(tǒng)存在缺陷[18]。這種免疫缺陷在PREISLER等[19]研究中得到證明,母畜圍產(chǎn)期淋巴細胞和單核細胞糖皮質(zhì)激素受體表達減少,這可能是由淋巴細胞和單核細胞表型或功能(或兩者)的改變引起,乳腺炎易感性增加。截至目前,對CD14基因在綿羊乳腺炎乳腺組織的相關(guān)研究還處于空白階段。因此本研究以綿羊為研究對象,運用生物分析學方法對CD14蛋白理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)及其不同物種間的同源性等進行分析預測。同時使用qRT-PCR、Western blot 與免疫組織化學染色的方法檢測CD14 mRNA與蛋白在健康和臨床型乳腺炎湖羊乳腺組織中的表達與分布情況,以期為進一步綿羊乳腺炎發(fā)病過程中有關(guān)細胞凋亡的分子調(diào)控機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集選用6只2歲齡湖羊母羊,均由平長湖羊繁育基地(甘肅,臨洮)提供,其中患有臨床型乳腺炎湖羊3只,健康湖羊3只。患病湖羊臨床癥狀為乳房發(fā)紅、發(fā)腫,乳房內(nèi)有硬結(jié),且乳汁稀薄有異味,變色呈灰白色或深黃色。健康湖羊則為乳房正常,且乳汁無異味呈乳香型。

1.2 主要試劑TRIzol RNA提取試劑盒、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)水、Tran Start Tip Green qPCR Super Mix和Passive Reference Dye、RIPA組織裂解液等均購自北京全式金生物公司;一抗兔源CD14(貨號:bs-1192R)購自Abcam;羊抗兔二抗(Goat Anti-rabbit IgG/HRP)、二抗DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒(SP-0022)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限責任公司。

1.3 樣品采集通過靜脈放血的方法處死試驗羊,采集其乳腺組織,其中一部分乳腺組織樣品通過超低溫保存,用于提取總RNA和蛋白質(zhì);用4%多聚甲醛固定其余樣品,用于制備石蠟切片。

1.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄使用TRIzol試劑提取組織總RNA,利用超微量分光光度計(Thermo Scientific,德國)檢測其總RNA濃度和純度。之后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明合成第一鏈cDNA。

1.5 引物設(shè)計與合成依據(jù)NCBI網(wǎng)站已公布綿羊CD14(登錄號:NM_001077209.2)和內(nèi)參蛋白β-actin(NM_001009784.1)序列,使用Oligo 7.0軟件設(shè)計引物并送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司進行合成。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.6 CD14生物信息學分析基于NCBI網(wǎng)站已公布的綿羊CD14基因CDS序列,采用BLAST進行同源序列的搜索;使用DNAMAN軟件對來自不同物種的CD14核苷酸和氨基酸序列進行多次對比;使用ProtParam在線程序?qū)D14的基本理化性質(zhì)進行預測分析;CD14蛋白信號肽由SignalP在線程序進行預測;跨膜結(jié)構(gòu)域由TMHMM在線程序進行預測;通過NetPhos在線程序?qū)α姿峄稽c進行預測;通過SOPMA、phyre2在線程序?qū)Χ壗Y(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進行預測分析。

1.7 qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL):上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,cDNA 1 μL,2×Tran Start TipGreen qPCR SuperMix 10 μL,ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件:94℃ 30 s;94℃ 5 s,60℃ 15 s,40個循環(huán);72℃ 10 s。使用2﹣△△Ct方法計算CD14 mRNA相對表達量。

1.8 Western blot使用RIPA組織裂解液提取總蛋白質(zhì)。利用12% SDS-PAGE進行電泳分離,將分離好的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF(polyvinylidenefluo-ride)膜上,封閉保存2 h后,分別加入兔源CD14一抗(1∶500)與β-actin 一抗(1∶1 500)4℃孵育過夜。用磷酸緩沖液(PBST)洗膜后,加入羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h,PBST再次洗膜后,加入ECL化學發(fā)光劑使蛋白陽性信號可視化。Western blot結(jié)果使用AlphaEaseFC圖像分析軟件進行測定。

1.9 免疫組織化學染色石蠟切片60℃烤片3～5 h 后,進行脫蠟、脫水、抗原修復處理,然后根據(jù)免疫組化試劑盒中的說明滴加3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,PBS洗滌后用試劑A封閉30 min,隨后分別滴加一抗(兔源CD14,1∶100)和PBS(陰性對照)于4℃ 孵育過夜。PBS洗滌后滴加二抗37℃孵育30 min,PBS再次洗滌后使用DAB顯色,終止染色,最后經(jīng)水洗、復染、脫水、透明后封片。免疫組織化學染色結(jié)果使用Sunny EX31 生物顯微鏡進行觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 CD14蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預測根據(jù)NCBI網(wǎng)站已公布綿羊CD14基因CDS序列長度為1 122 bp,編碼372個氨基酸。 ProtParam軟件分析,CD14基因編碼的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、理論等電點和分子式分別為93.14 kD、4.17和C3239H5358N1122O1337S366;氨基酸組成成分中,半胱氨酸是主要氨基酸(32.6%),其次為甘氨酸(30.4%)、蘇氨酸(19.1%)、丙氨酸(17.9%);CD14蛋白在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞中的半衰期為4.4 h,CD14蛋白的脂肪系數(shù)為17.91,平均親水值為0.883,CD14蛋白的不穩(wěn)定性系數(shù)為58.08,推測得此蛋白為疏水性不穩(wěn)定蛋白。

2.2 CD14蛋白信號肽及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域預測SignalP在線軟件預測結(jié)果顯示CD14具有信號肽,信號肽剪切位點位于20和21號氨基酸之間(圖1A);TMHMM在線工具預測結(jié)果顯示CD14不具有跨膜區(qū)域(圖1B)。可推測CD14蛋白為分泌蛋白。

A.信號肽;B.跨膜結(jié)構(gòu)域

2.3 磷酸化位點預測運用Netphos在線軟件對CD14蛋白磷酸化位點預測,結(jié)果顯示具有磷酸化位點;其中CD14蛋白具有59個蘇氨酸(Thr)位點(圖2)。

圖2 CD14蛋白的磷酸化位點分析

2.4 CD14蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預測通過SOPMA在線程序?qū)D14蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示,CD14蛋白由161個無規(guī)卷曲(43.28%)、150個α螺旋(40.32%)、40個延伸鏈(10.75%)、21個β轉(zhuǎn)角(5.65%)組成(圖3 A);CD14(圖3 B)蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示其組成成分與二級結(jié)構(gòu)相似,由無規(guī)卷曲、α螺旋、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角組成,且進一步在空間上擴展。

2.5 CD14基因CDS序列與其他物種間同源性分析根據(jù)序列比對結(jié)果如表1所示,綿羊CD14基因的CDS序列與山羊的氨基酸序列同源性最高為98.39%,與駱駝的同源性最低為74.93%;表明CD14基因在不同物種間進化水平相近。

2.6 CD14 mRNA在綿羊乳腺組織中的表達qRT-PCR結(jié)果顯示,CD14 mRNA在健康與臨床型乳腺炎綿羊乳腺組織中均有表達,且患有臨床型乳腺炎乳腺組織中的CD14 mRNA的表達量顯著(P<0.05)高于健康組(圖4)。

2.7 綿羊乳腺組織中CD14蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示,CD14蛋白在綿羊健康乳腺組織與臨床型乳腺炎乳腺組織中均有表達,且臨床型乳腺炎乳腺組織中的CD14蛋白的表達量極顯著(P<0.01)高于健康組(圖5),與CD14 mRNA結(jié)果基本一致。

圖3 CD14蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預測

表1 綿羊CD14基因CDS序列與不同物種間同源性比較

圖4 CD14 mRNA的表達特征

圖5 乳腺組織中CD14蛋白的檢測

2.8 免疫組織化學檢測CD14蛋白在綿羊乳腺組織中表達與定位染色陽性產(chǎn)物呈黃褐色,表明有該蛋白的分布。免疫組織化學染色顯示,CD14蛋白陽性信號在健康和臨床型乳腺炎乳腺組織中的分布和強度不同;在健康綿羊乳腺組織細胞中CD14蛋白主要存在于基質(zhì)細胞中;而在患有臨床型乳腺炎綿羊乳腺組織中則強烈分布于基質(zhì)細胞和乳腺上皮細胞中(圖6)。

A、B.分別為健康和臨床型乳腺炎乳腺組織中CD14蛋白的表達;C、D.分別為健康和臨床型乳腺炎乳腺組織的陰性對照;EC.乳腺上皮細胞;SC.基質(zhì)細胞

3 討論

CD14為LPS受體,存在于單核細胞、白細胞等表面分化抗原,具有識別、結(jié)合LPS及其復合物,在LPS介導的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[20]。LPS能夠引起哺乳動物發(fā)生免疫反應(yīng),進而導致促炎因子的釋放[21]。相關(guān)研究表明,CD14可識別特殊病原體表面的脂蛋白,從而激活CD14/TLR1-TLR2/p38 MAPK通路,誘導促炎因子分泌引起機體的炎癥反應(yīng)[22]。本試驗通過對CD14基因序列進行預測,結(jié)果顯示CD14基因CDS序列長度為1 122 bp,編碼372個氨基酸;通過與其他物種氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn),CD14基因在不同物種間的進化保守性較高,這可能由CD14基因不同的生物學功能決定。

有研究表明,CD14單核細胞被認為是炎癥性疾病的潛在治療靶點,CD14的差異表達與抗原的加工和呈遞、炎癥反應(yīng)、單核細胞的激活密切聯(lián)系[23]。在胡蓉等[21]的研究中,對CD14基因的功能進行抑制,特異性的阻斷CD14與LPS及LPS復合物結(jié)合,能夠阻止以炎癥反應(yīng)為主的病理反應(yīng)的發(fā)生。不僅如此,MARTEAU等[24]對患病組與健康受試者基因進行篩選比較,發(fā)現(xiàn)在高血壓、肥胖或肥胖相關(guān)高血壓個體中CD14基因表達存在差異。此外,HOPWOOD等[25]對人類骨關(guān)節(jié)炎患者差異表達基因進行篩選,同樣發(fā)現(xiàn)CD14基因的差異表達。在CD14與炎癥性疾病研究中,王曉敏等[26]對化膿性牙髓炎患者研究發(fā)現(xiàn),CD14呈現(xiàn)高表達,而經(jīng)過治療后,表達水平降低。鄧偉等[27]通過檢測變應(yīng)性鼻炎患者血清中發(fā)現(xiàn)CD14水平顯著高于正常人群,并與疾病嚴重程度呈正相關(guān)。本試驗中,臨床型綿羊乳腺組織中CD14 mRNA和蛋白均顯著高于健康組,與上述研究結(jié)果類似,推測在綿羊臨床型乳腺炎乳腺組織中,CD14基因的高表達與乳腺炎的發(fā)生密切聯(lián)系。FU等[28]研究表明,黃芩苷通過抑制CD14的表達,可抑制LPS誘導的TLR4/NF-κB p65通路激活和小鼠炎癥反應(yīng)。YOSHIO等[29]通過對產(chǎn)后母牛的初乳進行檢測,發(fā)現(xiàn)CD14蛋白水平表達較低的母牛在產(chǎn)犢后1周內(nèi)表現(xiàn)出感染乳腺炎的幾率顯著增加。SLADEK等[30]通過檢測患有乳腺炎母牛乳腺組織中發(fā)現(xiàn)CD14蛋白表達水平顯著高于正常母牛。進一步對CD14蛋白在健康和臨床型乳腺炎乳腺組織中的定位檢測發(fā)現(xiàn),CD14蛋白強烈分布于臨床型乳腺炎綿羊乳腺組織中的基質(zhì)細胞與乳腺上皮細胞。推測可能是由于CD14基因表達上調(diào),導致患臨床型乳腺炎乳腺組織中基質(zhì)細胞與乳腺上皮細胞中炎癥反應(yīng)加劇。因此,維持CD14基因表達量處于正常水平,對控制臨床型綿羊乳腺炎的發(fā)生和治療具有重要意義。