4-萜烯醇對沙門菌的抗菌機制

連凱琪,孟 蕊,王夢婷,張向麗,王國棟,張明亮,張坤朋*,周玲玲*

(1.安陽工學院 河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室/河南省藥用植物綜合利用工程技術研究中心/博士后創新基地,河南 安陽 455000;2.河南農業大學 動物醫學院,河南 鄭州 450046)

沙門菌的危害主要表現在能導致人和動物感染傷寒、副傷寒和胃腸炎等疾病,還可以引起食物中毒,嚴重危害公共健康安全[1]。隨著養殖業的發展,動物源性細菌耐藥性可通過食物鏈傳播最終對人類的健康產生嚴重影響[2]。目前臨床治療有四環素類、氟喹諾酮類、β-內酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類等多種抗菌藥物,養殖業普遍采用β-內酰胺類抗菌藥物進行治療[3]。但由于長期不合理使用或濫用抗生素類藥物,使沙門菌的耐藥問題每況愈下[4-5]。為避免耐藥性的提高,尋找抗生素替代品或協同藥物成為當前亟待解決的問題[6-7]。

前期研究發現,4-萜烯醇對革蘭陽性菌中的金黃色葡萄球菌(S.aureus)具有良好的抗菌活性[8]。本試驗選擇沙門菌作為代表菌株,研究4-萜烯醇對革蘭陰性菌的抗菌作用。通過對4-萜烯醇處理過的沙門菌的形態進行觀察,同時對沙門菌胞內ATP、堿性磷酸酶等內容物泄露情況檢測,證明4-萜烯醇對沙門菌具有良好的體外抗菌效果,可以破壞沙門菌的細胞膜,增大其通透性。本研究為進一步深入探索4-萜烯醇的抗菌機制提供了思路。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑沙門菌ATCC 13076(血清型:O1,9,12:Hg,m:-)由河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室保存。濃度≥95%的4-萜烯醇溶液(貨號W224847)購自Sigma-Aldrich;DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司;堿性磷酸酶(ALP)試劑盒與三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒購自Beytime;電鏡固定液購自武漢谷歌生物科技有限公司;細菌DNA提取試劑盒、胰蛋白胨、酵母浸出物、肉湯培養基均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 4-萜烯醇對沙門菌最小抑菌濃度(MIC)測定取100 μL 過夜培養的沙門菌,用滅菌的 PBS緩沖液稀釋至2×105CFU/mL。在超凈工作臺中取出4排96孔細胞培養板,第1行每孔加入50 μL氨芐霉素作為陽性對照;第2行每孔加入50 μL滅菌PBS作為陰性對照;第3,4行的第1孔加入4-萜烯醇,終濃度為0.128 mol/L,然后倍比稀釋至第8孔。各孔再加入50 μL稀釋好的菌液,封口后置37℃培養16 h。每孔加入10 μL刃天青溶液,再次用封口膜覆蓋,37℃恒溫培養30～60 min,期間觀察顏色變化。有細菌生長時刃天青溶液由藍紫色變為粉紅色,最后1個藍紫色孔的4-萜烯醇濃度即為其對沙門菌的MIC。

1.3 4-萜烯醇對沙門菌時間抑菌曲線將培養至對數生長期的沙門菌按體積比1∶100轉接至4個滅菌試管中,每管加入不同體積的4-萜烯醇溶液,使其終濃度分別為1,4,8 MIC,另一組加滅菌 PBS 作為陰性對照。將試管置于恒溫搖床37℃、220 r/min培養,每隔2 h取1次樣,取至12 h,然后繼續培養至24 h再取樣1次。每次取樣后用封口膜覆蓋并于4℃保存。用多功能酶標儀測量所取樣品在600 nm 處的D值。

1.4 掃描電子顯微鏡觀察將培養至對數生長期的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成2管。加入適當體積的4-萜烯醇溶液,使其終濃度為1 MIC,同時用滅菌PBS設置陰性對照。37℃水浴1 h,4 000 r/min離心5 min,棄上清液,無菌PBS洗滌2次。用電鏡固定液重懸,室溫條件下固定菌體2 h后,于4℃保存,送武漢賽維爾生物科技有限公司進行樣品處理和觀察。

1.5 核酸與蛋白質泄露檢測將培養至對數生長期的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成4管。向重懸液中加入4-萜烯醇(終濃度分別為1,4,8 MIC),并用滅菌PBS設置陰性對照。于37℃水浴中孵育,每隔1 h取200 μL樣品,4 000 r/min離心5 min,取上清液測定D260和D280的值。

1.6 ALP含量測定將培養好的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成5管。其中3管加入4-萜烯醇(終濃度分別為1,4,8 MIC),同時設置PBS作為陰性對照和0.3%的Triton X-100作為陽性對照。將樣品37℃水浴1 h。12 000 r/min 離心5 min,分離上清于新離心管中用于后續測定。按照說明書要求配置標準品和顯色底物,低溫保存。取96孔板,第1列每孔加不同體積的標準品工作液和檢測緩沖液,再加50 μL的顯色底物用吸液槍吹打混勻。其余孔分別加入50 μL樣品,再加入50 μL顯色底物用吸液槍吹打混勻。用封口膜覆蓋,放置在恒溫培養箱,37℃孵育30 min。孵育結束后每孔加入100 μL反應終止液。用多功能酶標儀在405 nm處測定D值。

1.7 胞內ATP含量測定將培養好的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成4管,其中3管加入4-萜烯醇,使其終濃度分別為1,4,8 MIC,同時用PBS設置陰性對照。于37℃水浴1 h。4℃離心棄上清,加200 μL裂解液,低溫靜置裂解。4℃離心后轉移100 μL上清,低溫保存備用。按說明書制備標準品,按要求操作消耗ATP背景值,防止其對結果產生影響。第1列分別加入20 μL不同濃度的標準品,其余孔分別加入20 μL處理好的樣品。靜置20 s后用多功能酶標儀檢測其D值。

1.8 4-萜烯醇對沙門菌DNA的影響將培養至對數生長期的菌液按照細菌DNA提取試劑盒說明提取DNA,并用紫外分光光度計檢測DNA的濃度。取6個100 μL無菌離心管,每管加入0.5 μg DNA,然后加入4-萜烯醇,使其與DNA的質量比分別為0,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,每管總體積為20 μL。37℃水浴中30 min。將反應后的樣品進行核酸凝膠電泳,并用凝膠成像儀觀察結果。

1.9 統計學分析數據采用GraphPad Prism 6軟件進行分析。*P<0.05 表示差異顯著,**P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 4-萜烯醇對沙門菌最小抑菌濃度通過刃天青指示劑檢測4-萜烯醇對沙門菌的MIC,結果顯示,兩處理組均在第5孔出現了顏色變化,則第4孔的濃度為4-萜烯醇對沙門菌的MIC,即0.016 mol/L(圖1)。

圖1 4-萜烯醇對沙門菌的MIC

2.2 4-萜烯醇對沙門菌的抑菌曲線為了研究4-萜烯醇對沙門菌的具體抑制時間和抑制強度,測定了抑菌曲線。結果表明,與對照組相比, 1 MIC 4-萜烯醇處理組至少在24 h內可以完全抑制沙門菌的生長(圖2),說明4-萜烯醇不僅可以很好的抑制沙門菌的生長繁殖,而且其結構較為穩定,不會輕易被沙門菌代謝物降解。

圖2 4-萜烯醇對沙門菌的抑菌曲線

2.3 掃描電子顯微鏡觀察結果由圖3可知,與對照組菌體相比(圖3A,B),經4-萜烯醇作用后的沙門菌菌體皺縮、菌體表面變得粗糙(圖3C,D)。結果表明4-萜烯醇對沙門菌的菌體形態產生了影響。

2.4 核酸與蛋白質泄露檢測如圖4所示,經4-萜烯醇處理后,沙門菌的核酸和蛋白質發生明顯的泄露,1 MIC處理組核酸、蛋白質的泄露量隨著4-萜烯醇作用時間的延長而逐漸增多;4,8 MIC兩個處理組則是在作用1 h就基本達到了最大泄露量。這說明低濃度4-萜烯醇的作用效果可以隨著作用時間的延長而增強,且對沙門菌的作用效果呈劑量依賴性。

A,C.PBS處理組;B,D.4-萜烯醇處理組

圖4 4-萜烯醇對沙門菌核酸(A)和蛋白質泄露(B)的影響

2.5 ALP含量測定結果如圖5所示,1 MIC處理組的沙門菌ALP出現泄露,且其泄露程度與陰性對照組相比呈顯著性差異,4,8 MIC以及陽性對照3個處理組ALP的泄露程度與陰性對照組相比呈極顯著性差異。這說明4-萜烯醇可以破壞沙門菌的細胞壁,造成ALP泄露,且泄露程度與4-萜烯醇的濃度呈正相關。

2.6 ATP含量測定ATP 含量測定結果如圖6所示,與對照組相比,1 MIC 4-萜烯醇處理組的沙門菌胞內ATP含量極顯著降低,4,8 MIC 2個處理組相比于1 MIC處理組其ATP含量下降更加顯著,說明沙門菌的能量機制損傷隨4-萜烯醇濃度的增大而加重,兩者呈正相關。

2.7 4-萜烯醇對沙門菌DNA的影響不同濃度4-萜烯醇與沙門菌DNA作用結果如圖7所示,處理組DNA條帶的亮度與對照組相比沒有發生降解和拖帶,這說明4-萜烯醇不具有降解沙門菌的DNA的作用,并且也不與沙門菌的DNA結合。

圖5 4-萜烯醇對沙門菌的ALP泄露的影響

圖6 4-萜烯醇對沙門菌胞內ATP含量的影響

M.DL2000 DNA Marker;1～6.4-萜烯醇和沙門菌的質量比分別為0,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0

3 討論

隨著國家無抗綠色健康養殖政策的推廣,開發天然產物抗菌藥物越來越受到廣泛關注[9-11]。4-萜烯醇作為多種植物提取物活性成分之一,是一種天然存在的單萜,微溶于水,溶于醇類和油類,因此在試驗中常制成水乳劑使用。CORDEIRO等[12]表明,4-萜烯醇與金黃色葡萄球菌的PBP2a蛋白結合并抑制其活性,PBP2a蛋白的產生是金黃色葡萄球菌誘導-內酰胺廣泛臨床耐藥性的主要機制。MERTAS等[13]研究表明,4-萜烯醇可增強氟康唑活性,降低其對白色念珠菌的MIC,將4-萜烯醇等天然物質與氟康唑等常規藥物結合使用可能有助于治療難治性酵母菌感染。MONDELLO等[14]證明4-萜烯醇在體內可以控制白色念珠菌陰道感染。純化后的化合物有望用于治療陰道念珠菌病,尤其是對氟康唑類耐藥的念珠菌病。FERRINI等[15]表明4-萜烯醇對莫匹羅星、夫西地酸、萬古霉素、甲氧西林和利奈唑胺的葡萄球菌耐藥菌株均具有活性,這些表明4-萜烯醇具有良好的抗菌作用。本研究主要探索了4-萜烯醇對沙門菌的作用機制,最初通過刃天青試驗評估了4-萜烯醇對沙門菌的MIC,繼而從時間抑菌曲線結果看出1 MIC 4-萜烯醇可以在24 h內持續抑制沙門菌的生長與繁殖。掃描電子顯微鏡結果顯示,經4-萜烯醇處理后的沙門菌的結構變化主要是菌體之間黏連、菌體皺縮。

ALP是一種位于細胞膜和細胞壁之間能將對應底物去磷酸化的酶,如果細胞壁遭受損傷,可以從上清液中檢測ALP[16]。在本研究中,經4-萜烯醇處理的沙門菌上清液中ALP熒光信號隨4-萜烯醇濃度的增加而增強,ALP含量變化可能是由于沙門菌細胞壁被破壞導致ALP泄露,并且泄露程度與4-萜烯醇的濃度呈正相關。核酸和蛋白質在1 MIC處理組時泄露量隨著時間延長而逐漸增多,4,8 MIC 2個處理組則是在第1小時達到最大泄露量。兩種物質的泄露趨勢說明在高濃度4-萜烯醇處理下,可能在短時間內對沙門菌細胞結構形成嚴重損傷,導致核酸和蛋白質迅速外流,而低濃度的4-萜烯醇則會隨著時間的延長逐步破壞沙門菌的細胞結構。ATP 作為細胞內重要的能量物質,經常被用于評價細菌或細胞的能量代謝水平[17-18],其含量大幅度降低更說明沙門菌的正常生理功能遭受到了嚴重破壞[19]。4,8 MIC 2個處理組ATP含量極顯著下降也與4,8 MIC 2個處理組核酸、蛋白質短時間內迅速泄露的結果相呼應。沙門菌胞內 ATP 含量下降有3種可能:沙門菌細胞結構完整性被破壞,導致胞內 ATP 泄露至上清液中;沙門菌細胞通透性增強,內容物泄露,導致能量合成機制被損傷,無法順利合成ATP;沙門菌應激,導致ATP消耗量急劇上升,其合成量遠遠小于消耗量。至于ATP含量降低的真正原因還需要進一步研究。除了已檢測出的ALP、核酸和蛋白質等物質的泄露外,還有可能導致其他物質泄露,如鈣離子等電解質物質,繼而導致膜電位出現異常[20]。同時沙門菌應激過程中是否會導致活性氧產生,啟動細胞凋亡機制等還有待深入探索[21]。

本研究表明4-萜烯醇對沙門菌具有較強的抑菌活性,通過破壞沙門菌的細胞膜和細胞壁結構完整性,使胞內核酸、蛋白質、ALP等內容物發生不同程度的泄露,能量物質ATP含量無法維持正常,最終影響沙門菌的正常代謝,從而無法正常生長繁殖。本研究初步探索了4-萜烯醇對沙門菌的作用機制,為后續開發天然化合物作為抗菌藥物以減緩更多耐藥菌的出現提供了理論基礎。