1株大鯢源多重耐藥維氏氣單胞菌全基因組解析及其致病性

郝成森,劉 佳,王 艷,駱澤禮,宋振輝,張立武,楊曉偉,,趙光偉,*

(1.西南大學 動物醫學院,重慶 榮昌 402460;2.上海海關,上海 200135;3.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司,重慶 榮昌 402460)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是氣單胞菌科(Aeromondaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)的成員,該菌革蘭陰性、兼性厭氧并具有運動能力[1],呈世界性分布,并具有廣泛的宿主范圍,對畜禽、水產動物和免疫力低下的人具有較強的致病性,是一種典型的人-畜-水生動物共患病病原菌[2]。繁殖過程中可產生氣溶素、腸毒素、黏附因子等毒力因子,可引起人的胃腸炎、蜂窩織炎、腦膜炎以及敗血癥等[3];致病性維氏氣單胞菌感染狐貍造成腸道積氣,心臟、肺臟、腎臟等主要臟器出血等病變,引起死亡[4];在水生動物中該菌引起的疾病更為常見,大口黑鱸、錦鯉、草魚、中華鱉、中華絨鰲蟹、中國大鯢等均有維氏氣單胞菌感染的報道[5-9],患病動物表現皮膚潰爛、內臟出血、腹水等多種臨床癥狀,對養殖業危害較大。

中國大鯢(Chinese giant salamander)屬于國家二級保護動物,已被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅰ[10-11],因其極高的科研、觀賞、保健、藥用及食用價值,其人工繁育產業在我國發展迅猛,生產區主要集中在我國陜西、四川、重慶、貴州、湖南、湖北等地。人工養殖過程中大鯢細菌性疾病時有發生,其中維氏氣單胞菌也是常見的細菌病之一,感染后大鯢皮膚及四肢潰爛、腹腔大量積液,病死率高。而在治療及預防這類疾病的過程中,又由于抗生素使用的不規范以及餌料、水環境污染等眾多因素,導致耐藥性菌株不斷出現,增加了防控的難度。本試驗針對前期分離的1株大鯢源多重耐藥菌株進行全基因組測序以及致病性和耐藥基因的檢測,以期為該病原的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株維氏氣單胞菌CQ-AV1株分離自重慶市開州某大鯢人工繁育場,患病大鯢皮膚及肢體潰爛、腹水。分離菌經16S rDNA和gyrB測序鑒定確定為維氏氣單胞菌,藥敏試驗顯示CQ-AV1株對多種β內酰胺類、氨基糖苷類和四環素類藥物有耐藥性,為多重耐藥菌株。分離菌加甘油保護劑于-80℃ 保存。

1.2 主要試劑細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技有限公司;2×Rapid Taq Master Mix和DL2000 DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司;引物合成及PCR產物測序在北京六合華大基因重慶分公司完成。

1.3 實驗動物健康大鯢30尾,購自陜西漢中紅星大鯢養殖場,6月齡,體長(20±5)cm,體質量為(100±10)g,飼養于本實驗室安靜的暗環境中,室溫18～25℃,每天換水1次,飼喂養殖場配送餌料;SPF昆明鼠10只(20～25 g,雌性),購自重慶國家生物產業基地實驗動物中心。

1.4 主要分析軟件和數據庫Trimmomatic(http://www.usadellab.org/cms/index.php),HGA(https://github.com/aalokaily/Hierarchical-Genome-Assembly-HGA),SSPACE(https:// www.Base clear.com/ services/bioinformatics/basetools/),QUAST(http://bioinf.spbau.ru/quast),Barrnap 0.8(https:// github.com/tseemann/barrnap),VFDB數據庫(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria,http://www.mgcacc n/VFs/download),CGE數據庫(Center for Genomic Epidemiology,http://www.genomicep idemiology.org/)。

1.5 維氏氣單胞菌純培養及擴增取-80℃保存的維氏氣單胞菌CQ-AV1株劃線接種于LB平板,于30℃恒溫生化培養箱培養24 h。挑取單個菌落至LB液體培養基,30℃振蕩培養至D600值為1.0,3 000×g離心20 min,收集菌體。

1.6 細菌DNA的提取利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA,微量分光光度計測定DNA純度和含量,確保D260/280在1.8～2.0之間,D260/230值在2.0以上,低溫送至成都羅寧生物科技有限公司進行全基因測序。

1.7 文庫構建及測序采用全基因組鳥槍法(whole genome shotgun,WGS)策略,構建約350 bp 大小的文庫,基于Illumina HiSeq測序平臺的雙端測序PE150測序方法進行測序。首先使用Covaris M220對鑒定合格的基因組DNA進行超聲破碎隨機片段化,形成一系列在350 bp左右的DNA小片段,在片段的兩個末端加上接頭,使用Illumina公司TruSeqTMDNA PCR-Free Sample Prep Kit構建大小為350 bp的單鏈DNA文庫。使用測序試劑盒HiSeq 3000/4000 SBS Kit(300 cycles)FC-410-1003進行測序,將構建好的文庫種到已連接引物的測序芯片上(Flowcell),產生互補雜交,再加入dNTP和聚合酶,以此連續重復進行橋式PCR擴增,DNA鏈的數量以指數增長,最后形成單克隆DNA簇。利用邊合成邊測序的原理:加入特定DNA聚合酶及帶有4種熒光標記的dNTP進行延伸,一個循環只延伸一個正確互補的堿基,后用激光掃描根據4種不同的熒光信號讀取堿基種類。以此重復,直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。最后統計每個循環所讀取到的熒光信號結果,獲得完整序列信息。

1.8 測序數據的組裝、注冊及注釋利用Trimmomatic軟件對測序數據中產生的低質量和污染序列進行修剪和過濾,去除接頭污染,切除兩端堿基質量小于3的堿基。使用HGA V1.0進行序列組裝,并通過軟件SSPACE、QUAST軟件對組裝后的結果進一步的校正和評價。將全基因組序列信息注冊至GenBank數據庫中,并通過NCBI上的原核基因組注釋通道PGAP(prokaryotic genome annotation pipeline)對組裝后的基因組序列進行注釋。全基因組序列與已注冊的其他菌株進行比較,構建系統進化樹,進而將全基因組序列在上傳至VFDB數據庫,對其毒力基因進行分析,獲得該菌株相關毒力因子信息;將全基因組序列在上傳至 CGE數據庫,利用其ResFinder數據庫分析比對該菌株所攜帶的耐藥基因,獲得該菌株的耐藥信息。

1.9 致病性試驗參考其他動物源維氏氣單胞菌致病性試驗的感染劑量[4-9],首先將CQ-AV1株菌液濃度調整為9.5×108CFU/mL,腹腔注射小鼠(n=5)0.5 mL,另有5只小鼠僅腹腔注射等量生理鹽水作為對照;感染后每天觀察小鼠的精神狀態和發病情況,及時剖檢死亡小鼠,觀察其病變。隨后,調整CQ-AV1株菌液濃度為6.0×108CFU/mL進行大鯢的致病性試驗,共分為6組(n=5),其中1～5組為感染組,第6組為陰性對照注射生理鹽水,5個感染組分別腹腔注射濃度為6.0×108,6.0×107,6.0×106,6.0×105和6.0×104CFU/mL的菌液0.5 mL,觀察并記錄大鯢的發病及死亡情況,觀察時間為30 d。對發病死亡的大鯢進行剖檢、觀察其病變情況,并取其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織進行病理切片,HE染色后觀察其病變特征,同時進行細菌的分離以驗證科赫法則。

2 結果

2.1 全基因組測序結果測序結果經過濾后得到的高質量DNA序列,通過軟件HGA V1.0對序列進行組裝,共獲得41個重疊群(contigs),組成36個scaffolds數據,總長度4 782 590 bp,其中最大的scaffold有425 514 bp。將組裝好的全基因組序列注冊到GenBank數據庫中,登錄號為:RZII00-000000.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/RZII00000000)。通過GenBank中原核基因組注釋通道PGAP對CQ-AV1進行基因結構的注釋,發現該菌基因組GC含量為58.48%,有5個rRNA和75個tRNA基因,其中rRNA包括:3個5S rRNA,16S rRNA和23S rRNA各1個;tRNA基因預測到22個同種型,其中Leu類最多,有8個,其次是Gly、Thr、Ser類各7個;基因組編碼基因共4 323個,假基因62個;通過對蛋白編碼基因中存在的信號肽序列進行分析,蛋白中共有4 378個信號肽位點。

2.2 系統進化樹的繪制將大鯢源菌株CQ-AV1與GenBank中其他動物源維氏氣單胞菌菌株序列進行比對,構建系統進化樹。結果發現CQ-AV1與豬源菌株(A5、A136、A86、A34和A31株)位于同一分支,具有最近的親緣關系;與鱸魚源菌株(BAQ-071013-135株)和羅非魚源菌株(UDRT09和NK01株)相鄰,親緣關系次之;與人源菌株親緣關系最遠,如AK247、CN17AOO29、553-SP、CN17A0154和71506株等。

圖1 CQ-AV1菌株與GenBank中其他動物源維氏氣單胞菌菌株構建的系統進化樹

2.3 毒力基因注釋VFDB數據庫注釋CQ-AV1菌株的毒力因子有7大類(表1),分別是氣溶素(aerolysin)、溶血素(hemolysin)、直接血紅素攝取蛋白系統(direct heme uptake system)、菌毛相關蛋白(Pili-related protein)、鞭毛相關蛋白(Flagella related protein)、Ⅱ型分泌途徑蛋白(type Ⅱ secretion system protein,T2SS)和Ⅲ型分泌途徑蛋白(type Ⅲ secretion system protein,T3SS)。注釋的毒力基因總共有159種,共320個。其中鞭毛蛋白類最多(163個),其次是菌毛蛋白(56個),最少的是氣溶素和直接血紅素攝取蛋白,均只有2個。

2.4 抗生素耐藥基因注釋ResFinder數據庫比對發現表明發現CQ-AV1菌株中存在5個耐藥基因(表2),分別為氨基糖苷類aac(3)-IId、β-內酰胺類AmpS、blaCEPH-A3、blaTEM-1B和四環素類Tet(E)。

表1 VFDB數據庫注釋CQ-AV1菌中毒力相關基因

表2 ResFinde數據庫注釋CQ-AV1耐藥基因結果

2.5 致病性試驗結果感染組小鼠腹腔注射CQ-AV1株菌液后10 h內全部死亡,死亡小鼠可見腹部膨大,剖檢發現腸腔內充滿氣體,內臟充血;陰性對照組小鼠均無異常。

CQ-AV1株菌腹腔接種大鯢后24 h,5個感染組均出現行動減緩,表皮黏液脫落現象;72 h時6×108感染組1條大鯢死亡,腹部注射處皮膚紅腫、潰爛(圖2A),同組另1條大鯢出現腹部膨脹癥狀(圖2B);6×107感染組也出現1條腹部膨脹的大鯢,其余感染組均未出現異常;觀察期結束后,6×108感染組死亡率20%,其余4個感染組均無死亡;對感染死亡大鯢剖檢,發現肝臟、腎臟、肺臟充血腫大,腹腔積液,胃腸充血(圖2C),與自然感染結果相似;陰性對照組中國大鯢均無任何異常。

圖2 CQ-AV1菌株6×108感染組死亡大鯢臨床及剖檢結果

病理組織學觀察發現感染組發病大鯢主要臟器中存在充血、出血和炎性細胞浸潤等病變。患病大鯢肝細胞出現腫脹,嚴重的表現為空泡變性、壞死,狄氏間隙內枯否氏細胞增多(圖3A);脾臟組織結構破壞,脾索排列紊亂,脾竇、脾小結內紅細胞增多,淋巴細胞核腫大、溶解(圖3B)。肺臟組織中炎性細胞增多,間質內出現大量絲網狀纖維蛋白,黏膜下出現大量紅細胞(圖3C)。腎臟結構被破壞,毛細血管內皮細胞變性壞死,整個囊腔充滿纖維蛋白,腎小管中可見蛋白管型(圖3D)。而陰性對照組大鯢各臟器均正常。

3 討論

維氏氣單胞菌在自然界中分布廣泛,在水環境、土壤和水生動物中報道較多,是一種對人、畜、魚均具有感染性的致病菌,具有一定的公共衛生意義[1],特別是在水生和兩棲動物中,近年來維氏氣單胞菌感染引起鯉、鯽、鰻和鱘等魚類以及蝦、蟹和鱉等動物發病的報道很多[5-9],本試驗菌株分離自患病大鯢,進一步說明該菌感染譜廣泛。結合致病性試驗結果,CQ-AV1對小鼠具有較強的致死性,人工感染后小鼠均在12 h內急性死亡,然而將菌株按不同劑量接種大鯢,盡管所有大鯢都表現出一定的運動遲緩、表皮黏液脫落等現象,但僅在最高劑量組(6×108CFU/mL)出現2尾死亡,而較低劑量的(6.0×106,6.0×105和6.0×104CFU/mL)3個組大鯢在出現一過性臨床表現后均無死亡,說明該菌對大鯢的致病性較弱,同時也反映出該菌對不同宿主的致病性存在一定的差別。

二代測序技術(next-generation sequencing,NGS)和生物信息學手段的發展對深入了解細菌的生物特征提供了幫助。本試驗通過全基因組測序及組裝成功獲得了CQ-AV1株的完整序列信息,系統進化樹分析顯示該菌與豬源維氏氣單胞菌的親緣關系最為接近,而與魚源和人源菌株相對較遠,經調查大鯢繁育場周邊有豬散養戶,存在豬-大鯢傳播的可能性。全基因組信息對進一步深入了解該菌的致病機制奠定了基礎,借助VFDB數據庫[12]發現CQ-AV1株的毒力因子主要包括鞭毛蛋白、T3SS、T2SS、氣溶素、溶血素、直接血紅素攝取蛋白和菌毛相關蛋白共320個。其中鞭毛蛋白和菌毛相關蛋白分別介導細菌的運動和黏附作用[13],T3SS通過運載毒力相關的效應分子以抵抗宿主自身的防御[14],而氣溶素和溶血素被認為是細菌產生致病性的效應毒力因子[15-16],尤其是氣溶素已經被證實是維氏氣單胞菌的主要毒力因子,可以破壞腸道組織使得菌體穿透腸道壁屏障而進入周身系統,本試驗中小鼠和大鯢感染后表現出的病理特征及臨床表現(如腸道鼓氣、肝臟等出血)與CQ-AV1菌株中氣溶素、溶血素等毒力因子的生物學效應一致。

維氏氣單胞菌的耐藥性也是困擾臨床養殖的一個重要問題,不同時空和宿主的菌株所表現出的耐藥性有很大差別,這對臨床藥物的使用提出了更高的要求,前期的試驗結果顯示CQ-AV1株對氨基糖苷類和β-內酰胺類藥物具有較強的耐藥性,本試驗通過ResFinder耐藥基因數據庫的注釋共發現了5個耐藥基因,其中β-內酰胺類最多,共有3種,包括AmpS、blaCEPH-A3和blaTEM-1B,此外還有氨基糖苷類aac(3)-IId和四環素類Tet(E)。在同一菌株中檢測到5種不同的耐藥基因,一方面能夠解釋菌株藥敏試驗所表現出對氨基糖苷類和β-內酰胺類藥物的耐藥現象,與其表型一致,且與臨床中經常使用卡那霉素、頭孢曲松、頭孢喹肟等藥物具有一定的相關性;另一方面也充分體現出維氏氣單胞菌耐藥的復雜性,這與以往報道[6-7]的氣單胞菌耐藥現象日趨嚴重是一致的。

β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的重要機制為質粒介導的AmpC β-內酰胺酶和超廣譜β-內酰胺酶的產生,進而水解藥物的β-內酰胺環,使酰胺鍵斷裂而失去抗菌活性[17],按照Ambler分類法將β-內酰胺酶分成了4類:即A類超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)、B類金屬酶(metallo-β-lactamases,MBL)、C類頭孢菌素酶(AmpC酶)和D類苯唑西林酶(OXA酶),值得注意的是本試驗CQ-AV1中blaTEM-1B屬于A類ESBLs,blaCEPH-A3屬于B類MBL,AmpS則屬于D類OXA酶耐藥基因,在同一個菌株中同時出現3種類型的耐藥基因在臨床分離菌株中是比較少見的,這進一步說明了耐藥情況的嚴重性和復雜性。此外,在一份我國臺灣地區調查[18]中發現,某些人源的氣單胞菌株(豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌)中,blaMOX和blaCEPH陽性菌株分別占調查菌株的29.4%(45/153)和7.8%(12/153),說明這些耐藥菌株已經對人類的健康構成了潛在威脅,因此規范養殖行業抗生素的使用以及對替抗產品(如中草藥)的研發是非常必要的。

CQ-AV1菌株中還檢測到含有氨基糖苷類耐藥基因aac(3)-IId和四環素類Tet(E),其中aac(3)-IId是產氨基糖苷類修飾酶中氨基糖苷乙酰轉移酶的成員之一,通過催化氨基糖苷藥物氨基或羥基的共價修飾,使得氨基糖苷類藥物與核糖體的結合減少而介導耐藥;Tet(E)是一種外排蛋白,可將四環素排出胞外從而降低胞內的藥物濃度,核糖體因此受到保護,從而產生了耐藥性,這是維氏氣單胞菌中研究較早的一種耐藥機制[19],后被證實Tet(E) 基因是介導氣單胞菌分離株對四環素類藥物耐藥的優勢基因[20],本試驗在CQ-AV1菌株中僅發現這一種四環素類耐藥基因,與其是優勢基因的結論一致。

綜上,本試驗首次對1株大鯢源多重耐藥維氏氣單胞菌進行了全基因組測序,通過生物信息學手段對其基因組結構、毒力和耐藥基因進行了分析注釋,為研究維氏氣單胞菌的分子流行病學、致病性及耐藥特征等方面提供了參考。