利用CRISPRi技術敲低海分枝桿菌PPE13基因

王垚垚,畢斯琪,陳 標,宋厚輝,楊 楊

(浙江農林大學 動物科技學院·動物醫學院 浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室/動物健康互聯網檢測技術浙江省工程實驗室,浙江 杭州 311300)

CRISPR即成簇的規律間隔的短回文重復序列,是一類廣泛分布于細菌基因組中的重復結構。目前CRISPR-cas9作為一種基因編輯工具,在編輯真核生物細胞的基因方面發展迅速[1-5]。雖然CRISPR-cas9技術是來源于細菌的自我保護免疫機制,但是基于CRISPR技術在細菌基因編輯和基因表達方面的應用發展卻相對有限[6-7]。同源重組是廣泛應用于分枝桿菌染色體基因沉默調控的一種基因功能的研究方法,然而轉化效率低是導致該技術同源序列置換失敗的主要原因,而且抗性基因的插入也可能會影響下游基因的表達[8]。此外,同源重組技術無法完成對必需基因的敲除。有報道通過在目的基因敲除的菌株中引入可被誘導表達的目的基因,來實現對必需基因功能的研究[9-11]。但這種方法無法真正地模擬目的基因在細菌正常生理狀態下mRNA的轉錄水平。CRISPRi是一種基于CRISPR-cas9調控基因表達的技術。CRISPRi中的dCas9無核酸酶活性,但可在sgRNA的指導下與靶序列特異性結合干擾正常的RNA轉錄,實現對靶向基因表達水平的可控調節[12]。已有研究利用CRISPRi技術成功敲低恥垢分支桿菌中的pknB和sigH基因,實現了對目的基因轉錄的干擾作用[13]。

海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum,M.marinum)是一種主要感染兩棲類和魚類的病原菌。研究表明,海分枝桿菌和結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)有較近的親緣關系,兩者核酸相似度高達95%[14],感染宿主的途徑類似[15],而研究海分枝桿菌的生物安全設施相對較低,故常被作為模式菌來研究結核分枝桿菌的生物功能。

PPE13屬于分枝桿菌 PE/PPE蛋白家族,該家族部分蛋白與其致病性相關,并且參與宿主細胞的免疫反應[16]。研究發現PPE13可促進巨噬細胞的死亡和相關IL-6的表達[17],同時也有研究表明牛分枝桿菌PPE13可激活NLRP3炎癥復合體,并促進IL-1β的分泌[18]。而海分枝桿菌PPE13具體致病機制有待研究。本研究使用分子克隆技術和CRISPRi技術構建出海分枝桿菌PPE13基因敲低菌株,顯著降低了海分枝桿菌PPE13基因的轉錄,研究結果為進一步探索PPE13蛋白調控結核分枝桿菌感染的具體機制提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料人源單核細胞(THP-1)、海分枝桿菌和大腸桿菌DH5α由本實驗室保存;質粒pRH2521、 pRH2502購自Addgene;限制性內切酶Bbs Ⅰ和T4DNA 連接酶購自NEB公司;DL2000 DNA Marker、無水四環素(anhydrotetracycline,ATC)購自TaKaRa公司;DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾維贊生物科技有限公司;卡那霉素和潮霉素購自Sigma-Aldrich公司;7H9、7H10培養基購自美國BD公司;OADC添加劑購自青島海博生物科技公司;細菌RNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;反轉錄試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司;1640培養基和胎牛血清購自Thermo Fisher公司。

1.2 sgRNA的設計在NCBI上檢索海分枝桿菌PPE13基因的序列,將PPE13所在的CDS區序列黏貼至CRISPR在線設計工具網站(http://crispr.mit.edu/),選擇綜合評分較高的sgRNA。根據pRH2521載體上BbsⅠ限制性內切酶的酶切位點,在選定的sgRNA序列5′端添加GGGA,對應互補鏈的3′端添加AAAC,設計出4個成對的序列(表1)。

表1 引物信息

1.3 含有sgRNA重組質粒的構建用限制性內切酶Bbs Ⅰ在37℃金屬浴中酶切pRH2521載體2 h,酶切體系:BbsⅠ 2 μL,pRH2521載體20 μL,10×CutSmart 5 μL,ddH2O 13 μL,回收酶切產物。將成對的sgRNA退火成雙鏈,與回收酶切產物進行酶連。將連接產物轉化至DH5α大腸桿菌感受態,在含有潮霉素的LB平板上篩選陽性單克隆菌落,挑取陽性菌,搖菌擴增,提取重組質粒pRH2521-sgRNA進行測序。

1.4 敲低菌株的構建將海分枝桿菌感受態細胞置于冰上解凍,向感受態細胞中加入1 μg pRH2502質粒,在冰上靜置20 min。取4 mmol/L的電轉杯進行電轉,電轉條件為電壓2 500 V,電容25 μF,電阻1 000 Ω。向電轉杯內加入200 μL的7H9培養基,再將全部液體轉移至分裝有600 μL 7H9培養基的1.5 mL EP試管中,避光30℃、100 r/min培養6 h。5 000 r/min離心5 min,棄上清,用60 μL 7H9培養基重懸菌體,涂布到含有卡那霉素的7H10 固體培養基中,30℃避光培養至生長出單菌落。挑取單菌落擴大培養,制備成含有pRH2502質粒的感受態細胞,再將攜帶有不同sgRNA的重組質粒pRH2521-sgRNA以相同的條件電轉到感受態中,涂布于含有卡那霉素和潮霉素的7H10固體培養基中,于30℃避光培養,篩選陽性單克隆菌落,搖菌備用。

1.5 敲低菌株的誘導表達取D600 nm約為1的海分枝桿菌,以1∶100接種到100 mL含有10% OADC添加劑的7H9培養基中,加入卡那霉素和潮霉素分別至終質量濃度為50 mg/L,30℃、100 r/min避光培養至D600 nm為0.1～0.2。再將菌液轉接到50 mL 7H9培養基中,設未誘導組和誘導組兩組。未誘導組不做處理,誘導組添加5 μL質量濃度為2 g/L的ATC誘導劑,使其終質量濃度為200 μg/L。加入誘導劑后不同時間檢測菌液D600 nm,每組取3個重復,繪制細菌生長曲線;另取適量菌液用于提取細菌RNA。

1.6 細菌RNA的提取使用柱式細菌總 RNA 抽提純化試劑盒提取細菌RNA。按照該試劑盒說明書進行細菌的收集和漂洗。為了提高RNA提取的效率,在加入溶菌酶和裂解液后加入適量的研磨珠,利用組織破碎儀進行破碎。然后再按照說明書用乙醇等其他試劑提取純化RNA。用酶標儀檢測RNA在260/280 nm處的D值。取500 ng RNA進行反轉錄,其余RNA于-80℃保存,以防降解。

1.7 PPE13和dCas9轉錄水平的檢測反轉錄使用ReverTra Ace qPCR RT Kit(with gDNA Remover),10 μL反應體系中加入500 ng RNA。各取1 μL cDNA,使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 通過qRCR檢測PPE13和dCas9的Ct值,每組設3個平行,以sigA為內參基因,采用相對定量的方法檢測目的基因的表達水平。引物序列見表1。

1.8 誘導劑質量濃度的選擇使用CRISPRi系統抑制目的基因的表達,誘導劑ATC的質量濃度發揮重要的作用。參照文獻[13]的方法,分別選用質量濃度為0,100,200,400和800 μg/L的ATC進行誘導,探索誘導劑質量濃度和目的基因轉錄水平兩者之間的關系。

1.9 海分枝桿菌在巨噬細胞THP-1內增殖情況檢測使用或不使用200 μg/L ATC作用于含有sgRNA1的海分枝桿菌重組菌株,24 h后分別將誘導菌株和非誘導菌株以MOI(細菌數∶細胞數)10∶1的比例感染THP-1細胞,感染后24 h裂解細胞,裂解液梯度稀釋至10-5,取10-3,10-4,10-53個梯度各10 μL,每個樣品取3個重復,點板至含有卡那霉素和潮霉素的7H10(含10% OADC)固體培養基中,避光靜置培養于30℃條件下,至生長出單菌落并統計結果。

1.10 數據分析利用GraphPad Prism 8軟件進行數據處理、圖形制作及統計分析,使用t檢驗的方法分析誘導前后D600 nm變化、目的基因表達差異和細胞內細菌存活數目變化的顯著性。數據表示為所獲數據的SD,*表示P<0.05(有差異),**表示P<0.01(差異顯著),***表示P<0.001(差異極顯著),ns表示無顯著性差異。

2 結果

2.1 pRH2521-sgRNA重組質粒的構建本研究使用的CRISPRi技術是通過ATC誘導質粒pRH2502、pRH2521分別表達出dCas9和sgRNA,兩者共同作用于DNA的特異性位點,阻止目的基因的轉錄過程,進而實現目的基因表達水平的降低[19-20]。前間區序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)為5′-NGG-3′,該種序列可促使dCas9-sgRNA復合體與靶基因的識別與結合。以NGG為PAM序列,在PPE13編碼區正義鏈上選擇了4條sgRNA,分別位于編碼區86,244,392,955 bp處(圖1)。將對應的sgRNA單鏈退火合成雙鏈后,將其與經酶切過的pRH2521質粒片段酶連,酶連產物轉化至大腸桿菌DH5α,菌落PCR篩選出陽性單克隆,測序并比對序列無誤,表明pRH2521-sgRNA重組質粒構建成功。

圖1 sgRNA靶位點選擇示意圖

2.2 海分枝桿菌敲低菌株的構建首先將含有dCas9的質粒pRH2502電轉至海分枝桿菌感受態中,涂布于含50 mg/L卡那霉素的7H10固體培養基上培養。挑選6個單菌落克隆,經菌落PCR驗證獲得3個含有pRH2502質粒的陽性克隆(圖2)。將陽性克隆擴增,制成含有pRH2502質粒的海分枝桿菌感受態細胞,再將重組質粒pRH2521-sgRNA電轉至該感受態細胞中,涂布于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L潮霉素的7H10固體培養基上培養。PCR驗證篩選出含有pRH2521-sgRNA重組質粒的陽性克隆(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～6.待驗證的菌落;7.陰性對照;8.陽性對照

M.DL2000 DNA Marker;1～4.分別表示sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4位點的不同pRH2521-sgRNA重組質粒;5.陽性對照;6.陰性對照

2.3 CRISPRi 敲低海分枝桿菌PPE13挑取敲低菌株的單克隆至含有ATC的7H9培養基中進行培養,對照組不加ATC。分別在培養后6,12,24,48 h收集菌體,進行細菌總RNA提取,qPCR檢測dCas9和PPE13的轉錄水平。結果顯示,和對照組相比,誘導組的dCas9轉錄水平在不同時間點均出現顯著升高,且基本呈現時間依賴性(圖4A,C,E,G)。設計的4條sgRNA中,sgRNA1對PPE13基因轉錄的抑制效果最佳,最高可達91.64%(圖4B);其次是sgRNA3,可使PPE13基因轉錄水平降低50%～60%(圖4F);sgRNA2和sgRNA4的抑制效果較差(圖4D,H)。

2.4 海分枝桿菌PPE13敲低對細菌生長的影響選取對PPE13轉錄水平有抑制作用的2株重組菌株(含有sgRNA1和sgRNA3的重組菌株),培養至含有或不含有ATC的7H9培養基中。在不同時間點檢測細菌D600 nm,并繪制海分枝桿菌PPE13敲低的生長曲線。結果顯示,和對照組相比,誘導組的D600 nm均沒有顯著性差異(圖5)。這說明敲低PPE13對細菌的生長無顯著性影響。

2.5 敲低PPE13對海分枝桿菌胞內增殖的影響用敲低PPE13的海分枝桿菌(含有sgRNA1的重組菌株)以MOI為10∶1感染THP-1細胞,在感染24 h后裂解細胞,倍比稀釋細胞裂解液,點板進行胞內CFU檢測。結果發現,和對照組相比,PPE13敲低后的胞內CFU數量降低至6.5×106,顯著低于對照組(圖6),這說明PPE13可以促進細菌在細胞內的增殖和生存。

2.6 誘導劑質量濃度的選擇選擇含有sgRNA1的重組菌株,向7H9培養基中加入不同質量濃度ATC(0,100,200,400,800 μg/L),檢測誘導24 h后dCas9和PPE13的表達情況。結果顯示,用質量濃度為200 μg/L ATC誘導的dCas9表達水平達到最高值(圖7A),而PPE13基因的轉錄水平卻隨著ATC質量濃度的增加而逐漸降低,用質量濃度為400 μg/L ATC誘導時PPE13的轉錄水平降至最低值(約為6%,圖7B)。

3 討論

由于分枝桿菌菌內基因重組效率非常低,針對分枝桿菌的基因敲除一直以來都是一個難題。雖然近年來研究者們廣泛利用轉座子突變、噬菌體轉導等技術來實現分枝桿菌基因的定向敲除,但這些技術只局限于對非必需基因的敲除,并且存在構建過程繁瑣耗時長、重組效率低等諸多缺點。而CRISPRi技術是一種基于誘導調控dCas蛋白表達、且不改變原有序列的基因敲低技術,可以更簡單高效的實現微生物的靶向基因調控,并且可用于必需基因的研究。相對于基因敲除,CRISPRi下調基因的轉錄水平更為可控[21-22]。SINGH等[13]成功利用CRISPRi靶向敲低了恥垢分枝桿菌的PknB、sigH基因;CHOUDHARY等[23]成功利用CRISPRi靶向敲低了結核分枝桿菌Rv1713(EngA)、Rv2150c(FtsZ)、Rv2460c(ClpP2)和Rv3417c(GroEL1)等基因。

A、C、E、G.dCas9和sgRNA誘導前后的dCas9表達情況;B、D、F、H.dCas9和sgRNA誘導前后PPE13表達情況

A.含有sgRAN1的重組海分枝桿菌;B.含有sgRNA3的重組海分枝桿菌

圖6 PPE13對海分枝桿菌胞內增殖的影響

圖7 不同質量濃度ATC誘導dCas9(A)和PPE13(B)的表達情況

強毒力的結核分枝桿菌和牛分枝桿菌是通過免疫機制的調控來逃避宿主細胞的攻擊,進而促進細菌在體內的繁殖擴散。PE/PPE家族部分成員的功能已被證實,但大多數成員的生物功能和機制仍不清楚[24]。本試驗用CRISPRi技術構建海分枝桿菌PPE13敲低菌株。在目的基因PPE13上設計4個sgRNA。每個sgRNA在識別PAM序列之后和靶基因中的20個同源堿基序列相結合,且每個sgRNA設計在模板鏈上,和非模板鏈結合。在設計的4個特異性sgRNA中,sgRNA1、sgRNA3基本實現了對目的基因的高效抑制。

sgRNA2在誘導前期抑制表達效果較明顯,24 h后抑制效果減弱甚至消失。sgRNA4的抑制表達效果最差。sgRNA2位點在前期發揮抑制作用,但后期抑制作用消失,這可能與脫靶有關。sgRNA2在誘導后期結合到基因組上其他位點,導致了即使dCas9的表達水平較高,但對PPE13的表達無明顯抑制作用。是否是由于脫靶導致的這種情況,有待進一步研究。雖然dCas9的表達水平較高,但sgRNA4對于PPE13表達的抑制作用卻并不明顯,這可能是由于sgRNA4較靠近編碼區3′端。LARSON等[25]研究也發現,當sgRNA靠近3′端時CRSIPRi的干擾效果較差。

本試驗也探索了不同質量濃度的誘導劑對目的基因的抑制能力的影響。和SINGH等[13]的研究結果一致,質量濃度為200 μg/L的ATC基本可以實現dCas9最高表達水平,質量濃度為400 μg/L的ATC誘導劑對目的基因的抑制程度最高。在一定條件下,基因的抑制程度隨誘導劑質量濃度的增加而增加。一些基因表達抑制試驗中可能不需要最大程度的抑制效果,因此可以通過控制ATC質量濃度的方式實現對基因表達抑制效果的調節。以達到適合試驗條件的最佳水平。

牛分枝桿菌侵入宿主機體后,通過吞噬作用進入到巨噬細胞內來躲避宿主免疫系統的攻擊[26]。因此,為研究PPE13是否和海分枝桿菌在宿主體內存活能力相關,本試驗利用海分枝桿菌PPE13敲低菌株感染THP-1細胞,檢測細菌在細胞內的存活情況。結果發現,PPE13可以促進細菌在細胞內的存活,有助于細菌在細胞內的增殖。而PPE13是否參與并調控炎癥反應,會影響哪些炎癥因子及具體的致病機制,仍有待于進一步研究。

綜上所述,本研究利用CRISPRi成功構建海分枝桿菌PPE13敲低菌株,初步發現敲低PPE13會降低細菌在細胞內的增殖能力,為進一步研究分枝桿菌PPE13基因的功能和致病機制提供了依據。