山羊源加勒多尼亞鏈球菌(Streptococcus caledonicus)的分離鑒定及耐藥性分析

李富祥,喻永福,朱 沛,楊仕標,趙文華,宋建領,高華峰*

(1.云南省畜牧獸醫科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室,云南 昆明 650224;2.石林彝族自治縣動物疾病預防控制中心,云南 石林 652200)

加勒多尼亞鏈球菌(Streptococcuscaledonicus)是2020年英國FOSTER等[1]分類命名的鏈球菌屬的一個新種。到目前為止,鏈球菌屬包括100多個細菌種,其中,絕大部分細菌種是人和動物重要的致病菌或條件致病菌[2-13]。到目前為止,S.caledonicus的分離鑒定的報道罕見,僅見英國從發病綿羊肺膿腫、胸腔積液、腦和胎兒樣品中分離到該細菌的報道[1],未見其他國家關于該細菌的研究報道。

2022年7月,云南石林縣某山羊養殖戶的奶山羊發生皮下膿腫,皮下膿腫主要發生在頸部、胸部和腹部,發病率為14.3%(8/56),嚴重影響羊只的生長和銷售,大大降低了養羊業的經濟效益。為明確病原,無菌采集2只羊的膿液進行細菌學診斷,從2只羊的膿液樣品中各分離到1株革蘭陽性鏈狀球菌,編號分別為YN220769和YN220770。并對2株分離株進行形態學、生理生化和16S rDNA基因鑒定,并分析2株分離菌的致病性和藥物敏感性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物哥倫比亞瓊脂和革蘭染色試劑盒購自杭州濱和微生物試劑有限公司;細菌基因組提取試劑盒、2×HotStart Taq PCR MasterMix和DL2000 DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司;Rapid ID32 STREP鏈球菌快速生理生化鑒定試驗條購自法國BioMerieux公司;青霉素、卡那霉素、頭孢噻吩等17種藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司;氟苯尼考藥敏紙片購自英國OXOID公司。體質量為18～22 g的昆明小鼠購自昆明醫科大學實驗動物學部。

1.2 引物設計細菌16S rDNA基因通用引物27F/1492R按照STACKEBRANDT等[13]報道的引物序列進行設計。

1.3 細菌分離將膿液樣品劃線接種哥倫比亞瓊脂平板,于37℃、5% CO2條件下培養48 h,挑選單菌落進行純培養獲得細菌分離株并將其編號。用細菌革蘭染色試劑盒將分離株進行染色鏡檢,觀察菌體形態。CO2生長需要試驗:將分離株接種哥倫比亞瓊脂平板,分別在普通空氣和37℃、5% CO2條件下培養72 h,觀察分離株生長特性。

1.4 生理生化鑒定利用Rapid ID32 STREP鏈球菌快速生理生化鑒定試劑條對分離株進行生理生化鑒定,過氧化氫酶試驗方法:挑取菌落至載玻片上,在菌泥上滴加3.0%過氧化氫溶液,有氣泡產生則為過氧化氫酶陽性,無氣泡產生為過氧化氫酶陰性。

1.5 16S rDNA基因測序利用細菌基因組提取試劑盒分別提取各分離株的基因組DNA作為PCR模板,采用引物27F /1492R PCR擴增16S rDNA基因,PCR反應條件參照文獻[13]報道的反應條件進行,利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳方法對PCR擴增產物進行鑒定,鑒定正確的擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序所得基因序列提交GenBank數據庫獲得基因登錄號。

1.6 16S rDNA基因同源性及遺傳進化分析將分離株16S rDNA基因在GenBank數據中進行BLAST比對(Blastn方法),下載同源性較高的16S rDNA基因序列以及鏈球菌屬部分模式菌株的16S rDNA基因序列,利用MegAlign軟件(Clustal W 方法)對分離株進行同源性分析。利用MEGA 4.0.2軟件構建系統進化樹(Neighbor-Joining進化樹),分析分離株與參考株16S rDNA基因的遺傳進化關系。在進化樹構建中,bootstrap values設定為1 000,選擇枯草芽孢桿菌模式菌株ATCC 6051T(ABQL01000001) 作為進化樹的外群。

1.7 致病性試驗將分離株接種營養肉湯,于37℃、5% CO2條件下培養48 h,5 000 r/min離心10 min,棄上清,用滅菌生理鹽水將菌泥重懸,用平板計數法測定菌懸液濃度,用滅菌生理鹽水將菌懸液濃度調整為1.2×107CFU/mL用于致病性試驗。每株分離株接種5只小鼠作為1個試驗組,每只小鼠股內側皮下接種菌懸液50 μL(即每只小鼠接種劑量為6.0×105CFU);對照組的5只小鼠股內側皮下接種滅菌生理鹽水50 μL;接種后的小鼠繼續飼養20 d,觀察臨床癥狀;第20天將小鼠剖檢觀察病理變化,分析分離株對小鼠的致病性。

1.8 藥敏試驗參照 CLSI2013 推薦的紙片擴散法對分離株進行藥敏試驗,結果以敏感、中介和耐藥進行判定,分析分離株對18種抗菌藥物的敏感性。

2 結果

2.1 細菌分離及生長特性分析2只羊膿液病料樣品接種營養瓊脂,培養24 h無可見菌落,培養48 h均長出大量純粹半透明小菌落,菌落直徑為0.5～1.0 mm。挑取單菌落進行純培養,從2只羊膿液病料樣品各分離到1株細菌,編號依次為YN220769和YN220770。2分離株在含5% CO2條件下生長良好,在普通空氣培養條件下不生長。2株分離菌均為革蘭陽性小桿菌,菌體直接約為0.5 μm,菌體成雙或成鏈狀排列,其中分離株YN220769的革蘭染色形態見圖1。2株分離菌的菌落和菌體形態以及生長特性與報道的S.caledonicus相符[1]。

圖1 分離株YN220770的革蘭染色形態

2.2 生理生化鑒定2株分離菌YN220769和YN220770生理生化特征相同,均表現為:產生β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶、丙氨酰基-苯氨酰基-脯氨酸-奈酚胺酶和N-乙酰葡萄糖胺酶;不產生精氨酸雙水解酶、α-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、焦谷氨酸芳酰胺酶、甘氨酰-色氨酸酶-奈酚胺酶、β-甘露糖酶、尿素酶和過氧化氫酶;分解D-乳糖、D-海藻糖、D-麥芽糖、甲基-B-D-吡喃葡萄糖苷和芽霉菌糖產酸;不分解D-核糖、D-甘露醇、D-山梨醇、D-蔗糖、D-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、α-環糊精、糖原和D-塔格糖產酸;馬尿酸鹽試驗陽性。2株分離株的絕大部分生理生化特征與報道的5株S.caledonicus分離株相同[1],僅少部分生化特征與報道的5株S.caledonicus分離株存在差異,其中馬尿酸鹽水解試驗陽性和不分解糖原產酸與報道的5株S.caledonicus分離株均不同,分解D-棉子糖、D-蜜二糖和D-松三糖產酸與報道的S.caledonicus部分分離株相同(表1),將2分離株初步鑒定為S.caledonicus。

表1 2株分離菌與5株英國分離菌不同的生化特征

2.3 16S rDNA基因序同源性分析將2株分離菌YN220769和YN220770的16S rDNA基因序列提交GenBank數據庫,得到基因登錄號分別為OP199089和OP199090。16S rDNA基因序列同源性分析結果顯示,2株分離菌之間的同源性為99.8%,分離株YN220769和YN220770與S.caledonicus模式菌株CCUG 73951T的同源性分別為99.7%和99.9%,2株分離菌與其他S.caledonicus參考株間的同源性為99.6%～100.0%,將2株分離菌進一步鑒定為S.caledonicus。

2.4 16S rDNA基因遺傳進化分析16S rDNA基因Neighbor-Joining遺傳進化樹顯示,2株分離菌YN220769和YN220770與S.caledonicus模式菌株CCUG 73951T以及其他S.caledonicus參考株形成同一個進化分支,其支持率高達100.0%(圖2),將2株分離菌最終鑒定為S.caledonicus。

2.5 致病性試驗2個試驗組全部小鼠均在接種菌液4 h后陸續出現精神稍差、活動減少;接種后12 h全部小鼠精神和活動恢復正常;接種后3～5 d全部小鼠接種部位均出現皮膚潰瘍;接種后20 d內均未出現膿腫。對照組小鼠接種滅菌生理鹽水后未出現臨床癥狀,剖檢也未出現病理變化。表明2株分離菌YN21118和YN22011對小鼠具有較強的致病性。

2.6 藥敏試驗藥敏試驗結果顯示,2株分離菌對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢吡肟、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢克洛、頭孢曲松、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、阿米卡星、四環素、氧氟沙星和氟苯尼考敏感,對磺胺甲惡唑耐藥。YN220769對慶大霉素敏感,YN220770對慶大霉素中介。

圖2 鏈球菌屬細菌16S rDNA基因序列Neighbor-Joining遺傳進化樹

3 討論

Streptococcuscaledonicus是2020年英國FOSTER等[1]分類命名的鏈球菌屬的一個新種,其命名是根據其模式菌株CCUG 73951T和其他分離株的來源地Caledonia而命名,因此,我們建議將Streptococcuscaledonicus譯名為加勒多尼亞鏈球菌。目前,國內外僅見FOSTER等[1]從綿羊中分離S.caledonicus的報道,本研究首次在山羊皮下膿腫的膿汁病料中分離到S.caledonicus,證實了山羊S.caledonicus感染的存在;并首次報道其致病性和耐藥性,為山羊S.caledonicus感染的預防和控制研究提供基礎數據和菌株資源。

在細菌生物學特性分析試驗中,2株分離菌YN21118和YN22011在含5% CO2條件下培養48 h 生長良好,但在普通空氣培養條件下培養72 h不生長,與FOSTER等[1]報道綿羊源分離株生長特性一致,本研究進一步證實S.caledonicus是一種典型的嗜CO2細菌,為S.caledonicus的分離鑒定提供參考方法。本研究首次對S.caledonicus的耐藥性進行分析,結果表明2株中國分離菌的耐藥性存在差異,分離株YN220769對慶大霉素敏感,而分離株YN220770對慶大霉素中介。2株分離菌YN21118和YN22011僅對磺胺甲惡唑耐藥,對16種抗菌藥物均敏感,其中青霉素和頭孢類抗菌藥物敏感性最高,可作為我國S.caledonicus感染治療的首選藥物。

本研究首次對S.caledonicus的致病性進行分析,結果表明,2株分離菌皮下接種6.0×105CFU能使100.0%接種小鼠發生皮膚潰瘍病理變化,表明其對小鼠具有較強的致病性;將每只小鼠接種劑量由6.0×105CFU增加到6.0×106CFU,仍然只能使100.0%接種小鼠發生皮膚潰瘍病理變化,不能使小鼠發生皮下膿腫病理變化,可能原因為小鼠不是S.caledonicus性皮下膿腫的敏感動物。由于本研究從山羊膿腫中僅分離到S.caledonicus,未分離到其他細菌;此外,FOSTER等[1]也報道了從綿羊肺膿腫中分離到S.caledonicus的報道;因此,我們推測S.caledonicus可能是山羊皮下膿腫的一種潛在新條件致病菌,該推測有待進一步用山羊致病性試驗加以證實。