犬2型腺病毒纖突蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

王樅嶸,牛欣蕊,郭江濤,魯維飛,劉忠虎,褚貝貝,付朋飛,王 江*

(1.河南農業大學 動物醫學院,河南 鄭州 450046;2.河南農業大學 農業農村部動物生化與營養重點實驗室,河南 鄭州 450046;3.河南農業大學 河南省動物生長發育調控重點實驗室,河南 鄭州 450046;4.河南城建學院 生命科學與工程學院,河南 平頂山 467036)

犬腺病毒(canine adenovirus,CAV)是哺乳動物腺病毒屬中致病性最強的一種[1]。CAV根據抗原性、血凝性和致病性等特性分為犬腺病毒1型(CAV-1)和2型(CAV-2)[2-4]。CAV-1 引起犬傳染性肝炎,多發于1歲以內的犬,臨床癥狀有發熱、眼鼻分泌物增多、角膜炎以及間質性腎炎等[5-6]。CAV-2在臨床上主要引起犬的傳染性喉氣管炎、咽炎、壞死性支氣管炎或肺炎等呼吸道疾病,臨床常表現為高熱、呼吸急促、干咳、漿液或膿性鼻漏及扁桃體腫大等,臨床特征常稱為“犬窩咳[7-8]”。此外也可引起出血性腹瀉等消化道疾病[9-10]。CAV-2的傳染性極強,傳播速度快,且往往易與其他病毒或細菌混合感染,導致犬大多預后不良。

CAV-2為線型雙鏈DNA病毒,基因組長為30～31 kb。病毒為無囊膜,二十立面體對稱結構,直徑為70～100 nm[11]。病毒粒子的外表面由纖突(fiber)、五鄰體基質(penton base)和六鄰體(hexon)衣殼組成[12]。纖突蛋白參與病毒的內化過程,在病毒侵染細胞過程中起關鍵作用,其介導病毒和宿主細胞受體之間的相互融合。纖突蛋白又可以分為3個基本結構功能區,包括小節、基軸和尾曲。纖突小節呈球形,具有與細胞表面上特異性受體結合的功能,及與細胞上受體結合和凝集紅細胞的作用[13],另外其還與腺病毒的組織親嗜性有關[14]。

本研究將CAV-2分離株CAV-HN45濃縮并滅活后作為抗原免疫BALB/c小鼠,經過一系列試驗篩選出2株靈敏性高、特異性強的針對CAV-2 FIBER蛋白單克隆抗體,為建立快速、高效的CAV-2免疫學檢測技術和基礎病毒學研究提供了材料,為我國對CAV-2的防控提供了備選抗體藥物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與動物CAV-HN45株分離自河南安陽某寵物醫院患病犬。SP2/0骨髓瘤細胞(本實驗室保存),犬腎細胞(MDCK,ATCC),感受態細胞Top 10由本實驗室制備。pEGFP-C1真核表達質粒(本實驗室保存)。表達CAV-2 FIBER的pEGFP-C1-CAV FIBER真核表達質粒由本實驗室構建、保存。聚偏二氟乙烯膜 (PVDF) 購自Millipore公司。HybGro雜交瘤細胞無血清培養基購自上海源培生物科技股份有限公司。β-丙內酯購自Solarbio公司。佐劑Quick Antibody-Mouse 5W購自北京博奧龍免疫技術有限公司。HAT/HT培養基、融合劑PEG1450、商業化β-actin鼠源單克隆抗體等均購自Sigma公司。Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)、Alexa FluorTM555 goat anti-mouse IgG(H+L)購自Thermo Fisher Scientific。HRP標記山羊抗小鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。AEC酶底物試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。蛋白質Marker購自Thermo Fisher公司。ProteinIso?Protein G Resin購自北京全式金生物技術有限公司。IgG抗體亞類鑒定試劑盒購自Si-no Biological公司。清潔級BALB/c小鼠購自鄭州大學第一附屬醫院。

1.2 CAV-HN45株的增殖與純化將MDCK細胞傳代于T75細胞培養瓶中,培養過夜。接種CAV-HN45株病毒液0.5 mL,24～36 h待出現90% 細胞病變后,凍融3次收毒,8 000 r/min離心10 min收集細胞上清,取上清通過蔗糖密度梯度離心法濃縮純化病毒,于-80℃保存備用。

1.3 CAV-HN45株病毒滅活與小鼠免疫取CAV-HN45株濃縮病毒液,加入β-丙內酯(終含量為0.2%)混勻后置4℃滅活48 h,將佐劑Quick Antibody-Mouse 5W與濃縮滅活病毒液等比例配制混勻,免疫病毒劑量為5 μg/只(免疫小鼠體質量為25～30 g),腿部肌肉注射免疫7周齡雌性BALB/c小鼠,首免3周后加強免疫1次,免疫劑量及方式同首免;首免5周后,取小鼠尾靜脈血,通過ELISA方法檢測血清抗體水平[15]。

1.4 細胞融合取抗體水平最高的小鼠處死并收集血清,無菌環境下取小鼠脾細胞與SP2/0細胞按10∶1的比例進行混合,離心棄上清。向細胞沉淀中以1 mL/min的速度滴加37℃預熱的PEG-1450 1 mL,37℃作用90 s進行融合,加入14 mL 37℃ 預熱的DMEM(邊加邊搖),37℃水浴5 min后,緩慢補加37℃ 預熱的DMEM至40 mL,終止融合。離心后棄上清,加適量的37℃ 預熱的加HAT的雜交瘤培養基混勻后鋪96孔板進行培養[16]。

1.5 單克隆抗體篩選

1.5.1IPMA試驗篩選分泌CAV-2單克隆抗體的雜交瘤細胞系 96孔板中鋪MDCK,接CAV-2病毒液約18 h,用預冷含3% H2O2的甲醇室溫固定15 min。PBST洗2次,5% 脫脂奶37℃ 封閉2 h。棄封閉液,PBST洗3次,加入融合細胞上清作為一抗,37℃ 孵育2 h;棄一抗,PBST洗3次,加入1∶1 000 稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG 二抗,37℃ 作用1 h。棄二抗,PBST洗3次,加入AEC顯色液室溫作用10～15 min,加入雙蒸水終止顯色反應,于顯微鏡下觀察,篩選出分泌CAV-2抗體的雜交瘤細胞系。

1.5.2IFA試驗篩選分泌CAV-2 FIBER蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系 將表達CAV-2 FIBER蛋白的真核重組質粒pEGFP-C1-CAV FIBER轉染至MDCK細胞中,24 h后用預冷的4%多聚甲醛于室溫下固定細胞30 min,1×PBS洗滌3次;用0.1% TritonX-100于室溫通透細胞膜10 min,1×PBS洗滌3次;使用含10%胎牛血清的1×PBS于室溫下封閉1 h,1×PBS洗滌3次;將制備的CAV單克隆抗體或雜交瘤細胞上清作為一抗與固定的細胞于37℃ 孵育1 h,1×PBS洗滌3次,加入1∶1 000稀釋后的Alexa FluorTM555標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)作為二抗,于37℃ 避光孵育1 h后,1×PBS洗3次;加入DAPI染色試劑于室溫避光孵育10 min,1×PBS洗滌3次、雙蒸水洗滌3次;加入封片劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察、分析并采集圖像。在1.5.1篩選結果的基礎上,用上述IFA試驗進一步篩選出分泌CAV-2 FIBER蛋白抗體的雜交瘤細胞,利用有限稀釋法進行亞克隆,直至得到能穩定的分泌CAV-2 FIBER蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。

1.6 腹水的制備及抗體純化取10～12周齡的BALB/c雌鼠,注射0.3 mL不完全弗氏佐劑。1周后,腹腔注射狀態良好的單克隆細胞2.5×106個/只,待小鼠腹部明顯隆起且按壓有波動感時收集腹水,將收集的腹水10 000 r/min 離心10 min,取上清進行初步純化。后將初步純化的腹水經硫酸銨沉淀法和ProteinIso?Protein G Resin進行純化,加甘油(最終濃度為25%～50%)將純化后的抗體質量濃度定至1 g/L,-20℃ 保存,并用SDS-PAGE凝膠電泳進行鑒定。

1.7 單克隆抗體生物學特性分析單克隆細胞染色體數目分析:將對數生長期的單克隆細胞和SP2/0細胞中加入0.3 g/L的秋水仙素液后,37℃、5% CO2培養6 h,離心收集細胞,低滲處理、固定制片、吉姆薩染色、鏡檢并拍照進行染色體數目計數分析。單克隆細胞分泌抗體的穩定性分析:將篩選出的單克隆細胞連續傳代培養3個月,用IPMA和IFA檢測細胞培養液中抗體水平。單克隆抗體亞型鑒定:按照Sino Bioligical小鼠單克隆亞類鑒定試劑盒說明書操作,鑒定CAV FIBER單克隆抗體亞類。

1.8 單克隆抗體間接免疫熒光試驗(IFA)效價測定取1.6步驟中純化腹水所得抗體,采用固定病毒-稀釋抗體法(β法)[17],以2倍倍比稀釋的單克隆抗體為一抗,1∶1 000 稀釋的Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)為二抗,對純化后的抗體進行IFA抗體效價測定。

1.9 單克隆抗體體外中和試驗(VNT)及抗體中和效價檢測采用終點法(β法)測定抗體中和效價,通過病毒回歸試驗,測得病毒感染工作濃度。在96孔板內,將系列稀釋的100 μL抗體 1-A12-C6、8-A12-B10與200 TCID50/100 μL的CAV病毒液等體積混勻,37℃、5% CO2培養箱孵育2 h。隨后接種MDCK細胞,100 μL/孔,同時設置MDCK細胞空白對照、病毒工作濃度(100 TCID50/100 μL)感染對照和僅接種2 種抗體作用的抗體對照, 37℃ 孵育2 h后,用1×PBS洗滌1次,隨即加入含1% 胎牛血清的DMEM培養基進行培養,3 d后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況(CPE)。

2 結果

2.1 免疫小鼠血清抗體水平通過ELISA方法檢測免疫小鼠血清的抗體效價,免疫的4只小鼠均能分泌CAV抗體,其中3號小鼠抗體效價最高,為1∶102 400(圖1),取3號小鼠進行加強免疫。

2.2 CAV FIBER蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立取加強免疫后的3號小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合,經HAT培養基篩選6 d后,明顯觀察到融合成功的細胞增殖(圖2),經IPMA和IFA對多株融合細胞進行篩選,最終獲得2株分泌CAV FIBER蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株,命名為1-A12-C6和8-A12-B10。IPMA結果顯示,制備的單克隆抗體可有效檢測CAV感染的MDCK細胞(圖3)。IFA結果顯示,上述2株雜交瘤細胞所分泌的抗體與感染CAV的MDCK細胞呈現特異性免疫反應,熒光顯微鏡下可見紅色熒光;且與轉染pEGFP-C1-CAV-FIBER質粒的MDCK細胞呈現特異性免疫反應,熒光顯微鏡下可見細胞內EGPF-FIBER的綠色熒光與抗原抗體結合的特異性紅色熒光共定位,表明該單克隆抗體可特異性檢測CAV FIBER蛋白(圖4)。

圖1 間接ELISA檢測首免35 d后小鼠血清中CAV抗體分泌水平

A.融合后2 d;B.融合后4 d;C.融合后6 d

A.1-A12-C6檢測CAV感染的MDCK細胞;B.8-A12-B10檢測CAV感染的MDCK細胞;C.陰性對照(SP2/0細胞上清為一抗組)

2.3 CAV FIBER蛋白單克隆抗體純化效果經SDS-PAGE凝膠電泳鑒定(圖5),純化后的抗體在大小約50,25 kDa處有2條明顯的蛋白條帶,分別為抗體的重鏈和輕鏈,而未見其他雜條帶。

2.4 單克隆抗體生物學特性分析對篩選出的雜交瘤細胞株染色體數目進行計數分析(圖6),平均染色體數目約為106條。利用抗體亞型鑒定試劑盒檢測顯示(圖7,表1),1-A12-C6為IgG2a型抗體,8-A12-B10為IgG2b型抗體。

A,D.SP2/0細胞上清為一抗的對照組;B,E.1-A12-C6 分泌抗體作為一抗;C,F.8-A12-B10分泌抗體作為一抗

M.蛋白質Marker;1.1-A12-C6純化前小鼠腹水;2.1-A12-C6小鼠腹水純化后抗體;3.8-A12-B10純化前小鼠腹水;4.8-A12-B10小鼠腹水純化后抗體

2.5 單克隆抗體的IFA效價測定將純化后的抗體用1×PBS進行2倍系列稀釋,作為一抗檢測感染CAV的細胞。結果顯示(圖8,表2),2株所純化抗體的IFA效價為1-A12-C6:1∶8 192;8-A12-B10:1∶2 048。

2.6 單克隆抗體中和活性及中和效價FIBER 蛋白位于CAV-2 病毒表面,在介導病毒感染中起重要作用。中和試驗結果顯示(圖9,表3),不進行任何抗體處理的CAV-2感染細胞組中可看到明顯的細胞病變,而抗體處理的CAV-2 感染細胞組中1-A12-C6、8-A12-B10分別最高可在1∶256,1∶64 稀釋倍數下有效阻斷CAV-2 感染,細胞未病變。另外,抗體處理的正常細胞組中,細胞形態正常,說明抗體對細胞不產生毒性。

A.SP2/0 細胞染色體數目;B.1-A12-C6 雜交瘤細胞染色體數目;C.8-A12-B10 雜交瘤細胞染色體數目

A.單克隆抗體1-A12-C6的亞類鑒定(1～3.1-A12-C6雜交瘤細胞上清;4.陽性對照;5.陰性對照);B.單克隆抗體8-A12-B10的亞類鑒定(6～8.8-A12-B10雜交瘤細胞上清;9.陽性對照;10.陰性對照)

表1 抗體亞型鑒定

表2 抗體免疫熒光效價

A.單克隆抗體1-A12-C6 免疫熒光陽性反應;B.單克隆抗體8-A12-B10 免疫熒光陽性反應;C.陰性反應

3 討論

CAV在全世界流行,能在多種哺乳動物中傳染,且傳染速度快,易發生群體感染[18-21]。CAV-2可引起犬科動物的傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、腸炎,往往與其他呼吸道病毒混合感染,混合感染時有較嚴重的臨床癥狀出現[22]。4月齡以下的幼犬易感染發病,主要通過唾液和糞便傳播,可在幼犬相互舔舐的過程中使全窩或者全群犬被感染,出現咳嗽癥狀,“窩咳”[23]。CAV-2 FIBER蛋白為病毒的纖突蛋白,相對分子質量約為62 kDa,在腺病毒侵染過程中起關鍵作用,該蛋白介導了病毒與宿主細胞受體之間的相互結合[24]。纖突蛋白不僅具有型和亞群特異性抗原決定簇,還與腺病毒不同血清型的抗原特異性相關[25-28]。

A.MDCK空白細胞對照組;B.病毒工作濃度感染對照組;C.1-A12-C6抗體處理正常細胞組;D.256倍稀釋1-A12-C6抗體處理病毒感染細胞組;E.8-A12-B10抗體處理正常細胞組;F.64倍稀釋8-A12-B10抗體處理病毒感染細胞組

目前臨床上沒有治療CAV-2的特效藥物及高免血清,因此針對該病一般采用對癥療法[29]。CAV-2患病犬在康復后,雖無臨床癥狀但體內仍可攜帶病毒6～9個月,這也導致該病在犬場長期傳播而不能被清除。國內預防CAV-2完全依賴國外進口的商品化疫苗,不能有效針對我國不斷進化的流行毒株,臨床上仍可見免疫后犬感染CAV出現毒力反強的情況[30-31]。常規的治療及疫苗接種無法有效地阻斷該病的傳播,防控該病需要堅持經常性的檢疫。因此快速準確的做出診斷在防控CAV中十分重要。但目前我國尚無標準化、商品化的CAV陽性血清及抗體供應[32]。臨床中商品化的敏感性強的快速檢測試紙條不僅被國外產品壟斷,而且檢測的敏感性差[29]。

本研究以CAV-2免疫小鼠制備了2株抗CAV-2 FIBER蛋白的單克隆抗體。IPMA和IFA結果表明,單克隆抗體能特異性識別CAV-2病毒及CAV-2FIBER蛋白。中和活性檢測試驗表明,單克隆抗體對CAV-2具有中和活性,中和效價不低于1∶64。為CAV-2的檢測、FIBER蛋白的功能研究、臨床診斷試劑盒的開發以及相關疾病的治療等具有重要意義。

表3 單克隆抗體病毒中和效價