一種水溶性佐劑CS-GTA-ML對H7N9亞型禽流感滅活疫苗免疫效果評價

尹文竹,許澤玉,鄧碧華,馬 芳,周明旭,王海燕,盧 宇,*,張金秋,*

(1.江蘇省農業科學院 動物免疫工程研究所 國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014;2.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,江蘇 南京 210014;3.南京農業大學 動物醫學院,江蘇 南京 210095)

目前,疫苗提高了預防傳染性疾病的能力,降低了患病風險。然而,對于一些免疫原性較差的滅活疫苗而言,佐劑是其中必不可缺的關鍵成份[1]。水性佐劑,即傳統的鋁鹽佐劑,主要誘導體液免疫應答,不能有效地刺激細胞免疫,同時會引起注射部位局部出現腫脹、紅斑、硬塊等不良反應。

殼聚糖(chitosan,CS)是一種來源廣泛、價格低廉、具有良好生物相容性、可降解性和安全無毒等特點的陽離子型天然高分子聚合物,目前被廣泛應用在畜禽飼料及疫苗佐劑。徐懷英等[6]利用其高度黏著性及長鏈結構,通過戊二醛乳化交聯新城疫病毒,制備成口服型新城疫微球疫苗,對強毒株有較強的保護性,且能同時促進體液免疫和細胞免疫。但天然的CS在生理pH值下無法溶解,難以發揮其生物學活性。因此,解決CS在純水中的溶解性問題,是提高其生物利用度的關鍵環節。其中CS結構中2-位氨基和3,6-位羥基是進行化學修飾的重要位點。據文獻報道,通過雙親性、季磷化[9-10]、季胺化、烷基化、羧基化等化學修飾對其電荷、結構、親疏水能力等進行改造,從而解決CS的溶解性問題。

遞送類載體佐劑配伍疫苗后通過細胞膜運輸到細胞內,通過溶酶體逃逸,最終將抗原釋放于細胞質才能發揮作用,其中溶酶體逃逸是的提高疫苗效力的關鍵步驟。溶酶體(lysosomes)為單層膜包被的囊狀結構,一般為真核細胞中的一種細胞器,其內部pH值4.5～5.5。嗎啉環(morpholine)具有弱堿性(pKa = 8.36)作為一種溶酶體靶向定位基團,在熒光探針領域被廣泛報道。此外,嗎啉環具有雙親性,更易透過細胞膜進入細胞內。當含嗎啉環疫苗進入溶酶體后,能在它的酸性微環境中質子化,使得溶酶體膜破裂,破壞了溶酶體結構,引發抗原在溶酶體逃逸,大量的抗原被精準地遞送給CD4 T細胞,引起強烈的免疫反應。

本試驗首先利用殼聚糖鏈2-位氨基與環氧丙基三甲基氯化銨(GTA)發生加成開環反應,制備水溶性CS季銨鹽CS-GTA中間體,然后再與4-(2-氯乙基)嗎啉(ML)進行N-烷基化反應引入具有溶酶體靶向的嗎啉環基團,制備了CS-GTA-ML聚合物。由于CS-GTA-ML的電正性,能與帶負電荷的抗原通過靜電作用包裹抗原,同時利用CS對細胞的黏附性和嗎啉環的溶酶體靶向性,實現抗原提呈和溶酶體逃逸,從而起到免疫增強效應和抗原遞送功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞4～6周齡ICR雌性小鼠購自揚州大學比較醫學中心。小鼠飼養于獨立的籠具中,自由采食與飲水,飼料過程中嚴格按照免疫程序進行免疫。SPF雞胚購自濟南鑫盛達生物工程有限公司。動物房定期消毒,室內溫度為(25±1)℃,濕度為(50±10)%。1%紅細胞(RBCs)由SPF雞采血分離得到。

1.2 主要試劑CS(MW=20 W)、1 mol/L PBS緩沖液均購自Sigma-Aldrich試劑公司。環氧丙基三甲基氯化銨(C6H14ClNO,)、4-(2-氯乙基)嗎啉(C6H12ClNO)、氫氧化鈉(NaOH,AR級)、乙醇(EtOH,AR級)等試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司(Sinopharm Chemical Reagent Co.)。DMEM培養基、RPMI1640培養基、胎牛血清均購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司產品。CCK-8試劑盒購自上海百賽生物技術股份有限公司。4%多聚甲醛、紅細胞裂解液、FITC anti-mouse CD3抗體、APC anti-mouse CD4抗體和PE anti-mouse CD8a抗體均購自上海生物科技股份有限公司。超純水由實驗室Millipore Milli-Q純水儀制備。小鼠細胞因子IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ 的ELISA試劑盒均購自上海酶免生物技術有限公司。

1.3 CS-GTA-ML的制備方法CS-GTA-ML的合成路線如圖1所示。

圖1 CS-GTA-ML的合成路線圖

1.3.1CS-GTA的制備 參照文獻[20]方法,取5 g CS、10 g GTA于250 mL圓底燒瓶中,加入70 mL去離子水,80℃攪拌反應8 h,反應至溶液澄清時停止反應。將反應液在85℃、35 r/min條件下旋轉蒸發。產物不完全蒸干,加入適量95%乙醇洗滌浸泡30 min后取出析出的固體物質。粗產品通過抽濾,濾渣繼續用適量95%乙醇攪拌洗滌。攪拌3 h后,再次抽濾,濾渣利用紅外燈干燥,得到白色固體純品CS-GTA(9.2 g)。

1.3.2CS-GTA-ML的制備 取2 g CS-GTA、2 g ML和1 g NaOH加入到100 mL圓底燒瓶中,加入30 mL去離子水,80℃攪拌反應12 h后停止反應。待溫度降至室溫后,加入適量95%乙醇洗滌浸泡30 min后取出析出的粗產品。采用相同的純化方式得到白色純品CS-ML-ML(2.5 g)。

1.4 體外細胞毒性檢測采集ICR小鼠脾臟且去除RBCs后,分離懸浮單一的脾細胞并細胞計數,加入96孔細胞板中保持 2×106個/孔,然后在37℃、5% CO2條件下孵育24 h;棄去培養基后加入100 μL含不同質量濃度CS-GTA-ML的培養基繼續孵育24 h;再次棄去培養基后,用PBS緩沖液洗滌1次;最后加入90 μL純DMEM培養基和10 μL的CCK-8試劑繼續孵育1 h,使用酶標儀(Bio-Rad,CA,USA)檢測D450 nm值。按照以下公式進行計算:

1.5 體外溶血試驗檢測采集SPF雞的新鮮血樣,1 000 r/min離心10 min收集RBCs。用PBS溶液洗滌3次,然后配制成1%的RBCs懸液,備用。將0.3 mL的 1% RBCs懸液分別加入到1.2 mL不同質量濃度(0.005～10 g/L)的CS-GTA-ML溶液中。以1% RBCs懸液分別加入超純水和PBS作為陽性對照和陰性對照。所有樣品利用渦旋振蕩儀快速振蕩30 s后在室溫下放置2 h。4℃、1 500 r/min離心10 min,使用酶標儀在D450 nm激發光下測定上清溶液的D值,并觀察541 nm處的最大D值。其溶血率(HR)由如下式計算:

1.6 HE組織染色試驗20只4～6周齡ICR雌性小鼠隨機分為試驗組和對照組,每組10只。試驗組腹腔注射200 μL CS-GTA-ML(1 g/L),對照組注射相同劑量的PBS緩沖液。7 d內觀察小鼠臨床反應并記錄其體質量變化。注射后7 d,將小鼠安樂處死,分別取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及注射部位皮膚組織,利用4%多聚甲醛進行固定,之后進行脫水、石蠟包埋、切片、染色,最后通過顯微鏡進行觀察。

1.7 小鼠體內免疫評價試驗48只4～6周齡ICR雌性小鼠隨機分為6組,每組8只。按表1進行背部皮下免疫,在接種后14,28,42 d采血并分離血清,用于血凝抑制效價檢測。所有動物試驗均符合江蘇省農業科學院實驗倫理要求。

表1 H7N9亞型禽流感滅活疫苗的小鼠免疫試驗分組 μL

1.8 SPF雞體內免疫評價60只6周齡SPF雞隨機分為6組,每組10只。按表2進行頸部皮下免疫,在接種后14,28 d采血并分離血清,用于血凝抑制效價檢測。所有動物試驗均符合江蘇省農業科學院實驗倫理要求。

表2 H7N9亞型禽流感滅活疫苗的SPF雞免疫試驗分組 μL

1.9 脾CD4+、CD8a+T淋巴細胞的流式分析隨機每組抽取3只免疫后28 d的小鼠,安樂處死后取出脾臟并分離脾細胞,細胞計數后調整為2×106個/150 μL的單分散脾細胞懸液,分別加入FITC anti-mouse CD3抗體、APC anti-mouse CD4抗體和PE anti-mouse CD8a抗體,4℃避光共孵育30 min,PBS洗滌2次后,通過BD AccuriTMC6 Plus流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 CS-GTA-ML的結構表征CS主鏈上引入嗎啉環和季銨鹽后得到CS-GTA-ML,CS-GTA-ML能被核磁共振氫譜(1H NMR)和傅里葉紅外光譜(FT-IR)所表征。

如圖2A所示,CS、CS-GTA和CS-GTA-ML在D2O中的1H NMR中,δ 1.97×10-6(綠色區域)為CS去乙酰化殘留甲基質子峰;和CS相比,CS-GTA和CS-GTA-ML分別在約3.21×10-6處觀察到一個非常強的峰值,表明季銨側鏈中的甲基基團存在;在紅色區域δ 2.494×10-6,4.381×10-6,3.413×10-6處的峰可以歸屬為H-a、H-b和H-c。和CS-GTA相比,CS-GTA-ML在藍色區域內出現一個新峰,表明嗎啉環被修飾在CS的主鏈上。利用峰寬半定量估算出GTA嫁接率約為53%,ML的嫁接率約為15%。

同樣利用FI-IR(圖2B)可以觀察到,CS被GTA修飾后,在約1 478 cm-1處出現N-CH3的C-H不對稱彎曲振吸收峰(綠色區域)。一般來說,甲基的C-H不對稱彎曲振動吸收峰約為1 430 cm-1。由于季銨鹽陽離子強的吸電子效應,使得其向高波數方向移動。ML被修飾到CS-GTA分子中后,出現1個1 127 cm-1的新峰[23]。與ML的紅外譜圖相比,可以認為它來自于ML環C-N伸縮振動吸收峰。這些數據進一步證實了CS-GTA-ML的結構。

圖2 CS、CS-GTA和CS-GTA-ML的1H NMR圖(溶劑為D2O)(A)、FI-IR圖(B)和Zeta電位圖(C)

從圖2C中可以看出,隨著CS主鏈上GTA、ML的嫁接,中間體CS-GTA和目標佐劑CS-GTA-ML仍帶正電荷分別為38.1,15.4 mV。配伍帶負電荷的H7N9亞型禽流感滅活抗原后,仍保持著12.5 mV的電正性。

此外,從表3中可以發現CS-GTA-ML在不同pH值下的水溶液中均可以溶解,在pH=5.5的酸性Tris緩沖液中最大溶解度為82.4 g/L;在pH=7.2的生理緩沖液(PBS)中最大溶解度為67.2 g/L;在pH=8.9的堿性Tris緩沖液中的最大溶解度為78.6 g/L。

表3 CS-GTA-ML在不同pH值下水溶液中的溶解度

2.2 CS-GTA-ML的生物相容性評價利用小鼠原代脾細胞為模式細胞器,配置不同質量濃度的CS-GTA-ML進行體外安全性評價。如圖3所示,當質量濃度低于50 mg/L時,CS-GTA-ML對脾細胞有增殖效果;當質量濃度達到200 mg/L時,其細胞存活率仍高達92%;當質量濃度高達2 000 mg/L時,脾細胞仍有73%左右的存活率。

從圖4的直觀圖中可以看出,隨著CS-GTA-ML質量濃度的提高,EP管中上清液呈無色透明狀,RBCs沉積在管底、仍無破裂。從光譜圖中也可以看出D值隨著CS-GTA-ML質量濃度的增加無明顯變化。當質量濃度高達10 g/L時,通過公式計算發現HR僅0.5%左右,幾乎沒有溶血現象。

隨后,對皮下注射后7 d小鼠連續觀察其生活和精神狀態,試驗組(CS-GTA-ML)小鼠飲食、睡眠及精神狀態正常,小鼠被毛柔順,注射部位未出現紅腫、發炎、脫毛等反應。進一步對小鼠的重要器官和注射部位皮膚進行病理切片分析(圖5),心臟、肝臟、脾臟、肺臟等臟器均無病變和損傷,其注射部位皮膚也未出現炎癥反應等。

圖3 不同質量濃度的CS-GTA-ML對原代脾細胞存活率

圖4 CS-GTA-ML的HR

圖5 小鼠注射1 g/L的CS-GTA-ML的組織病理觀察結果

2.3 CS-GTA-ML的血凝抑制效價評估利用免疫試驗驗證CS-GTA-ML的免疫增強活性。首先根據圖6的免疫方式和次數小鼠皮下免疫,并在免疫后7 d后開始采血進行檢測。如圖7所示,免疫后7 d,對照組與試驗組無顯著性差異(P>0.05);免疫14 d后,添加佐劑組疫苗免疫組小鼠血清HI效價均顯著提高,其中CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L組HI效價略高于ISA206+H7N9組(P<0.05)。至首次免疫后6周,隨著免疫時間的延長,CS-GTA-ML免疫組小鼠仍保持著較高的抗體水平。

定期監測小鼠的體質量變化,結果如圖8所示,免疫42 d后不同質量濃度的CS-GTA-ML的H7N9疫苗組小鼠均生長良好,與PBS組和純H7N9疫苗組相比較,小鼠體質量增加1.5 g左右,與ISA206+H7N9疫苗組小鼠體質量接近,各組之間無顯著性差異(P>0.05)。

由圖9可見,SPF雞皮下免疫14 d后,CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L組HI效價仍顯著高于H7N9組(P<0.001),且與ISA206+H7N9組HI效價無顯著性差異(P>0.05)。但是,免疫28 d后,CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L組HI效價仍顯著高于ISA206+H7N9組(P<0.05)。

2.4 細胞因子檢測通過ELISA試劑盒對免疫后28 d采集的小鼠血清進行IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ檢測。如圖10所示,與單一的H7N9疫苗對比,添加佐劑(ISA206和CS-GTA-ML)后,免疫后小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ均顯著上調;與ISA206+H7N9組相比,CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L 組小鼠血清的IL-2(P<0.05)、IL-6(P<0.05)和IFN-γ(P<0.05)表達量有顯著性升高,而IL-4的表達量無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 脾淋巴細胞中CD4+和CD8a+細胞亞群流式分析為了進一步研究CS-GTA-ML對淋巴細胞的作用機制,通過流式細胞分析不同免疫組對脾T淋巴細胞分化的影響。

皮下免疫不同疫苗組后28 d,通過流式細胞術檢測不同疫苗免疫組小鼠脾細胞中CD3+CD4+及CD3+CD8a+的比例。如圖11所示,試驗組小鼠脾細胞中CD3+CD4+T細胞比例顯著高于空白對照(PBS)組,且添加CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L或ISA206+H7N9的疫苗組免疫后,小鼠脾細胞中CD3+CD4+T細胞比例顯著高于單純H7N9抗原免疫組。另外,結合CD8a+/CD4+比值可以發現,CS-GTA-ML能顯著提高CD8a+T細胞的比例(圖11E)。

圖6 小鼠免疫試驗方案

圖7 小鼠免疫后血清的HI抗體

圖8 小鼠免疫后體質量變化

圖9 SPF雞免疫后28 d血清的HI抗體

圖10 小鼠免疫后血清中IL-2(A)、IL-4(B)、IL-6(C)和IFN-γ(D)的質量濃度

圖11 流式細胞儀檢測免疫不同組別小鼠的脾CD4+、CD8a+T細胞的表達

3 討論

免疫佐劑是配合抗原使用的無免疫原且增強抗原特異性免疫應答的新物質[24]。理想的免疫佐劑能在減少抗原用量及免疫次數的前提下產生高效免疫應答,便于生產和使用。傳統的獸用油乳佐劑因代謝緩慢造成不良反應,因而亟需開發新型佐劑。有研究發現,生物可降解材料CS已被證實具有佐劑性能,不僅能夠作為疫苗載體遞送[25-26],還能作為免疫增強劑[27]。通常將CS溶解在鹽酸溶液中,直鏈上的氨基吸附H+使其質子化,形成帶正電荷的結構,便于通過電荷響應負載抗原。但其僅能在酸性環境中溶解的缺點限制了進一步的佐劑應用。

本研究通過溫和的合成路線制備出CS-GTA-ML,并在不同pH環境下展現出良好的水溶性,通過體內外生物相容性試驗發現其無毒、生物相容性好,為注射劑型的應用提供試驗數據。配合滅活H7N9亞型流感病毒評估CS-GTA-ML的免疫增強性能,不同質量濃度CG-GTA-ML的血凝抑制效果不低于商品化的ISA206,且免疫42 d后仍有較高的血凝抑制作用,延長了免疫持續期。

CS刺激免疫效力有很多因素,如激活巨噬細胞、誘發研發性超敏反應和產生循環抗體、誘發殺傷性淋巴細胞(CD8+)、激發NK細胞及誘發細胞因子等。本研究首先通過對免疫后2周的血清進行細胞因子的檢測,發現CS-GTA-ML誘導機體分泌高水平的Th1型(INF-γ和IL-2)和Th2型(IL-6)細胞因子,初步判斷具有一定的體液和細胞雙重免疫。T淋巴細胞的活化及分化影響免疫途徑,其中CD4和CD8是兩個重要的細胞表面指標。CD4+T細胞能夠參與Th細胞TCR識別抗原的信號轉導,在免疫反應過程通常發揮輔助機體產生體液免疫和細胞免疫應答的功能,CD8+T細胞則是重要的效應細胞,具有殺傷靶細胞的功能。同時,CD4+/CD8a+的比值同樣可以說明免疫增強作用的大小。進一步探究對T淋巴細胞的分化,CS-GTA-ML刺激機體產生大量的CD4+T細胞,可能是MHC Ⅱ類分子通過溶酶體途徑遞呈進入淋巴細胞中,同時CD4+與CD8a+比值增加驗證T淋巴細胞趨向于CD4的分化,誘導機體分泌大量的體液和細胞免疫反應的細胞因子,增強了機體免疫應答能力。

因此,推測帶有正電荷的CS-GTA-ML靜電結合H7N9滅活疫苗后通過皮下注射到機體后,利用CS的黏著性將疫苗帶入到DC細胞中,并通過嗎啉環的靶向溶酶體后,引起“質子海綿效應”,使得溶酶體內環境吸收大量的H+,導致溶酶體膜內外滲透壓變化,使得溶酶體膜破碎,引發溶酶體逃逸能力,將H7N9抗原緩慢釋放至細胞質中,持續刺激機體產生體液和細胞雙重免疫。