豬偽狂犬病病毒變異株HN1201 gE蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

牛欣蕊,付朋飛,魯維飛,張 超,褚貝貝,王 江*,曾 磊*

(1.河南農業大學 動物醫學院,河南 鄭州 450046;2.河南農業大學 農業農村部動物生化與營養重點實驗室,河南 鄭州 450046;3.河南農業大學 河南省動物生長發育調控重點實驗室,河南 鄭州 450046;4.河南城建學院 生命科學與工程學院,河南 平頂山 467036)

豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的豬急性、致死性傳染病。該病呈暴發性流行,可引起妊娠母豬流產、死胎,公豬不育,新生仔豬大量死亡,育肥豬呼吸困難、生長停滯等[1-2];該病傳播速度快,20世紀60年代開始在全國范圍內傳播,給我國養豬業造成了巨大的經濟損失[3-5]。為了控制該病傳播,PRV Bartha弱毒疫苗在我國被廣泛使用,部分豬場轉變成PRV陰性場[6]。而2011年開始,我國北方多個豬場發生了嚴重的PR疫情,并迅速蔓延至我國北方大部分地區,在接種了PRV Bartha弱毒疫苗的豬場同樣發生了疫情。與之前的PRV流行株相比,此次疫情的PRV基因組部分氨基酸發生突變、插入與缺失,表現出毒力增強的特點,PR疫苗對PRV變異株感染沒有有效的保護作用[7]。本研究所用PRV變異株PRV HN1201與PRV Kaplan、Becker、Bartha基因組同源性分別為95.6%,95.9%和97.5%,表現出毒力增強的特點[8-9],因此,想要根除該病,除了疫苗免疫外,還應加強PRV野毒感染的檢測并及時淘汰野毒感染豬。

PRV是線性雙鏈DNA病毒,屬皰疹病毒科(Herpesviridae)、α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae),病毒粒子呈球形,有囊膜和衣殼。基因組可編碼約100種蛋白,其中gE基因位于PRV基因組的US區,長約1 740 bp,編碼gE糖蛋白,在病毒入侵神經系統過程中發揮重要作用[10-12]。gE蛋白有4個不同的功能區,胞外域、跨膜域、胞內域和 N 端信號肽,gE 蛋白胞外區域由 438 個氨基酸組成,是病毒的主要抗原表位區,通常gE與gI通過非共價鍵結合,以異源二聚體的形式存在[13]。gE蛋白是病毒復制的非必須蛋白,缺失后不影響病毒的免疫原性,但毒力顯著減弱。因此,PRV gE基因缺失疫苗被廣泛使用[13-17],可通過檢測gE蛋白來區分疫苗免疫和野毒感染[18]。本研究用PRV變異株HN1201滅活后免疫小鼠,經過一系列試驗篩選出2株靈敏性高、特異性強的PRV gE蛋白單克隆抗體,并對其針對的抗原表位進行鑒定,為研究PRV感染機制、PRV gE蛋白優勢抗原表位篩選以及建立快速、高效的PRV免疫學檢測方法提供了依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑PRV HN1201、PRV QXX、PRV Bartha K61、293T細胞、PK-15細胞、SP2/0骨髓瘤細胞、pEGFP-C1質粒、重組質粒pCDNA3.0-gE-HA均由農業農村部動物生化與營養重點開放實驗室保存;佐劑Quick Antibody-Mouse 5W購自Biodragon公司;HybGro培養基購自BasalMedia公司;β-丙內酯購自Solarbio公司;融合劑PEG1450、HAT/HT培養基、FITC標記山羊抗小鼠IgG(IgG-FITC)、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司;HRP標記山羊抗小鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術責任有限公司;AEC酶底物試劑盒購自ZSGB-BIO公司;ProteinIso?Protein G Resin購自TransGen Biotech公司;Protein L Resin 購自金斯瑞生物科技股份有限公司;IgG抗體亞類鑒定試劑盒購自Sino Biological公司。

1.2 PRV HN1201病毒的增殖與純化將PK-15細胞接種至T75細胞培養瓶,待細胞長至90%時接種PRV HN1201病毒液,細胞90%病變時,反復凍融3次,收集細胞培養物,8 000 r/min離心10 min去除細胞碎片,然后通過30%蔗糖層超速離心,純化上清中的病毒。

1.3 小鼠免疫與抗體水平檢測取PRV HN1201病毒濃縮液按500∶1比例加入β-丙內酯,混勻,4℃處理48 h對病毒進行滅活,之后按1∶1比例加入免疫佐劑Quick Antibody-Mouse 5W,混勻,按100 μL/只腿部肌肉注射免疫7周齡BALB/c小鼠。首免21 d后同劑量進行二次免疫,首免35 d后選擇血清抗體水平較高的小鼠進行加強免疫。通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測免疫小鼠抗體水平:用PRV HN1201感染PK-15細胞約16 h,用含3%過氧化氫(H2O2)的甲醇固定細胞,取未免疫小鼠血清作為陰性對照,將免疫小鼠血清進行2倍系列連續稀釋作為一抗,Goat anti mouse IgG-HRP作為二抗,按照ELISA反應條件進行篩選。

1.4 細胞融合取免疫后小鼠,無菌分離其脾臟細胞,在37℃將脾細胞與SP2/0細胞按10∶1的比例混合后1 200 r/min離心10 min,輕彈離心管使細胞沉淀混勻,加入1 mL 預熱的PEG-1450,37℃作用90 s,然后連續加入DMEM至40 mL,1 000 r/min離心10 min,加入預熱的含有HAT的培養基,混勻,鋪細胞至96孔板進行培養。

1.5 單克隆抗體篩選

1.5.1免疫過氧化物酶單層細胞試驗(immune peroxidase monolayer assay,IPMA)篩選分泌PRV抗體的雜交瘤細胞 鋪PK-15細胞于96孔板,待細胞生長至70%～80%時,用PRV HN1201感染,同時設置正常細胞為陰性對照。感染16 h后,用預冷的含3% H2O2的甲醇室溫固定細胞15 min,PBST洗2次;加入5%脫脂奶,37℃封閉2 h,PBST洗3次;加入雜交瘤細胞上清,37℃孵育2 h,PBST洗3次;加入1∶1 000稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗,37℃孵育1 h,PBST洗3次;加入AEC顯色液室溫作用10～15 min,棄顯色液,加入雙蒸水終止顯色反應,于顯微鏡下觀察,篩選分泌PRV抗體的雜交瘤細胞。

1.5.2分泌PRV gE蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞篩選及亞克隆 將表達PRV HN1201 gE蛋白的真核重組質粒pCDNA3.0-gE-HA轉染至293T細胞,通過Western blot試驗進一步篩選分泌PRV gE蛋白抗體的雜交瘤細胞,利用有限稀釋法進行亞克隆,直至得到能穩定分泌PRV gE蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。

1.6 單克隆抗體亞類鑒定按照IgG亞類鑒定試劑盒說明書操作,對PRV gE單克隆抗體亞類進行鑒定。

1.7 腹水制備及抗體純化10～12周齡BALB/c雌鼠,腹腔注射300 μL弗氏不完全佐劑,7 d 后腹腔接種分泌PRV gE單克隆抗體的雜交瘤細胞(3×106/只),同時設置腹腔注射SP2/0細胞的陰性對照小鼠。待小鼠腹部明顯脹大時采集腹水,10 000 r/min離心10 min,收集上清,即為單克隆抗體腹水。收集的腹水經飽和硫酸銨沉淀法和ProteinIso?Protein G Resin進行純化,加甘油(終濃度為50%)-20℃保存,用SDS-PAGE對純化后的抗體純度進行檢測。

1.8 抗體效價測定取腹水純化所得抗體,采用固定病毒-稀釋腹水抗體法,對其進行IFA抗體效價檢測。另外對已純化腹水抗體用于Western blot試驗的最佳稀釋度進行探索。

1.9 IFA鑒定抗體與不同 PRV毒株的反應性分別將PRV HN1201、PRV QXX、PRV Bartha K61接種于PK-15細胞,設置未接毒的細胞為陰性對照,16 h后,用4% PFA室溫固定細胞30 min,雜交瘤細胞上清作為一抗,FITC標記山羊抗小鼠抗體作為二抗,按照IFA反應條件進行操作,于熒光顯微鏡下觀察結果。

1.10 IFA檢測單克隆抗體交叉反應性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染Marc-145細胞,豬流行性腹瀉病毒(PEDV)感染Vero細胞,按照常規IFA方法操作,檢測單克隆抗體與常見病毒的交叉反應性。

1.11 單克隆抗體識別PRV HN1201 gE抗原表位鑒定利用生物學軟件SnapGene根據gE基因序列將gE基因截短為兩段重合的片段,設計引物,擴增目的片段,連接到pEGFP-C1載體中,構建真核表達載體,通過Western blot檢測,確定抗體針對的抗原表位所在片段,再對特異片段用同樣的方法繼續進行截短。

2 結果

2.1 免疫小鼠血清抗體水平通過ELISA方法測定滅活PRV HN1201免疫小鼠血清抗體效價,結果顯示7只小鼠均產生PRV抗體,其中1號小鼠抗體效價最高為1∶102 400(圖1),取1號小鼠加強免疫1次。

圖1 間接ELISA檢測首免35 d后小鼠血清中 PRV 抗體分泌水平

2.2 分泌PRV gE蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立將滅活后的PRV HN1201病毒免疫小鼠,取其脾細胞與SP2/0細胞融合,經HAT培養基篩選5～7 d后,明顯觀察到雜交瘤細胞增殖(圖2),經IPMA和Western blot對多株融合細胞進行篩選,最終得到2株穩定分泌PRV gE單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為1-F11-3、3-E11-3。IPMA結果顯示1-F11-3株單克隆抗體使感染PRV的PK-15細胞呈紅棕色(圖3),3-E11-3不能使感染PRV的PK-15細胞呈紅棕色;Western blot結果顯示,以1-F11-3、3-E11-3為一抗孵育PVDF膜,在相對分子質量100 kDa左右出現了特異性條帶,表明2株抗體均可特異性識別PRV gE蛋白(圖4)。

A.融合后5 d;B.融合后7 d

A.1-F11-3檢測PRV HN1201感染的PK-15細胞;B.3-E11-3檢測PRV HN1201感染的PK-15細胞;C.正常PK-15細胞

M.蛋白質Marker;1.PK-15細胞蛋白;2.PRV HN1201感染PK-15細胞蛋白;3.pCDNA3.0-gE-HA質粒轉染293T細胞蛋白

2.3 PRV gE蛋白單克隆抗體Ig亞類鑒定按照IgG亞類鑒定試劑盒說明書操作,通過ELISA方法對PRV gE單克隆抗體亞類進行鑒定。結果顯示,1-F11-3亞類為IgG2a,3-E11-3亞類為IgM,輕鏈均為Kappa鏈(圖5)。

A.單克隆抗體1-F11-3的亞類鑒定(1～3.1-F11-3雜交瘤細胞上清;4.陽性對照;5.陰性對照);B.單克隆抗體3-E11-3的亞類鑒定(6～8.3-E11-3雜交瘤細胞上清;9.陽性對照;10.陰性對照)

2.4 PRV gE蛋白單克隆抗體純化效果及抗體效價純化后的抗體經SDS-PAGE凝膠電泳,1-F11-3在50,25 kDa處分別為抗體的重鏈和輕鏈,3-E11-3在75,25 kDa處分別為抗體的重鏈和輕鏈(圖6)。純化后的1-F11-3、3-E11-3抗體用于Western blot檢測的最高稀釋比分別為1∶14 000和1∶12 000。1-F11-3抗體IFA檢測效價為2-14(圖7)。

2.5 IFA檢測單克隆抗體與不同PRV毒株反應及其交叉反應性IFA結果顯示,1-F11-3抗體能與不同PRV毒株反應,但不與PRV Bartha-K61反應(圖8A),且不與其他病毒發生交叉反應(圖8B)。

2.6 單克隆抗體識別PRV HN1201 gE抗原表位鑒定將PRV gE片段截短真核表達后,通過Western blot試驗,鑒定1-F11-3株PRV gE抗體識別gE抗原序列為64GDDRRAGFGSALASLR79,3-E11-3株PRV gE抗體識別gE抗原序列為156PPEVPRLRRGPPIVTPERWS175(圖9)。

M.蛋白質Marker;1.純化前小鼠腹水;2.小鼠腹水純化后抗體

圖7 IFA檢測小鼠腹水純化后PRV gE蛋白抗體效價

A.單克隆抗體1-F11-3與不同PRV毒株反應;B.單克隆抗體1-F11-3與其他病毒的交叉反應

3 討論

1947年,我國東部地區首次報道了PRV引起的病例[19]。1970年,PR在我國大部分地區廣泛流行,給我國養豬業造成了巨大的經濟損失[20-21]。gE蛋白是PRV主要的毒力蛋白,但缺失gE蛋白不影響病毒的免疫原性。為控制和根除PR,人們廣泛使用gE基因缺失疫苗,至1990年以后該病得到了有效控制[22-23]。然而,2011年底,PRV變異株再次引起了PR的暴發,gE基因缺失疫苗(Bartha-K61)已不能提供有效的免疫保護[24-26],因此,在PR的防控工作中,除疫苗免疫外,還應加強PRV野毒感染的檢測并及時淘汰野毒感染豬。

由于市面上的PRV疫苗多為gE基因缺失疫苗,因此gE被認為是野生PRV毒株感染的指標,可以通過檢測血清中gE抗原或gE抗體來區分野毒感染豬和疫苗免疫豬。因此,PRV gE單克隆抗體在PR的防治和凈化過程中具有重要作用。

通過原核表達gE蛋白為免疫原制備的gE單克隆抗體,在識別天然gE蛋白時的特異性和親和力較差,這可能與原核表達gE蛋白缺乏天然構象和糖基化修飾有關。而以PRV全病毒顆粒為免疫原制備的gE單克隆抗體能有效識別天然gE蛋白,故本研究使用PRV抗原免疫小鼠。用ELISA方法檢測小鼠血清,選取抗體水平最高的小鼠脾臟進行細胞融合,然后,通過IPMA、Weatern blot和亞克隆等方法篩選獲得了2株能分泌PRV gE抗體的雜交瘤細胞,分別命名為1-F11-3和3-E11-3,亞類鑒定分別為IgG2a和IgM。

接下來用IFA方法進一步評估其特異性,1-F11-3單克隆抗體與含有gE的PRV特異性結合,不與gE缺失的PRV發生反應,說明該單克隆抗體特異性識別gE蛋白,且與PRV的其他結構蛋白無交叉反應;此外,通過IFA試驗確定該單克隆抗體不與PRRSV、PEDV、PCV-2、PPV發生交叉反應。3-E11-3單克隆抗體僅能通過Western blot方法識別gE蛋白,這可能與其識別的抗原表位的類型有關。通過抗原表位鑒定,2株抗體識別不同的gE抗原序列,分別為64GDDRRAGFGSALASLR79和156PPEVPRLRRGPPIVTPERWS175。純化后的1-F11-3、3-E11-3抗體用于Western blot檢測的最高稀釋比分別為1∶14 000和1∶12 000;1-F11-3株IFA效價達2-14,抗體靈敏度較高。

A.1-F11-3株單克隆抗體識別gE抗原表位的8個重疊的多肽示意圖;B.Western blot鑒定1-F11-3株單克隆抗體識別gE抗原表位;C.表達gE截短的蛋白的GFP標簽鑒定;D.3-E11-3株單克隆抗體識別gE抗原表位的6個重疊的多肽示意圖;E.Western blot鑒定3-E11-3株單克隆抗體識別gE抗原表位;F.表達gE截短的蛋白的GFP標簽鑒定

PRV gE蛋白作為具有重要的生物學和免疫學功能的蛋白,是制備單克隆抗體、疫苗研制、診斷試劑等方面研究的靶標物質。本研究成功制備了特異性強、靈敏度高的2株PRV gE單克隆抗體,并探究了單克隆抗體識別的特異性抗原表位。為建立快速、特異的PR血清學診斷方法和免疫預防等研究奠定了基礎。